PI3K之P85蛋白的WB檢測結果常見問題及解決方法
說起磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks），大家都不陌生，大量研究表明其是癌癥、血栓形成、炎癥及免疫性疾病的重要治療靶點[1]。尤其是p85/p-p85蛋白，更是多種通路研究繞不開的熱點。然而科研的成功不會像山坡上的蒲公英那樣唾手可得，在進行WB檢測p85/p-p85時，時常會遇到一些棘手的問題讓人苦惱不已。今天小優細節君就來和大家聊一聊p85/p-p85檢測的二三事。
PI3Ks是一個脂質激酶家族，可以通過磷酸化細胞內肌醇脂質來調節信號傳導和細胞內小泡運輸。哺乳動物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產生3-磷酸肌醇脂質，其直接激活信號轉導途徑。除了在癌癥中經常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發性免疫疾病中也發現了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內吞途徑、內體循環和自噬中膜交通的調節因子，通常對細胞信號傳導具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調控亞基復合的異二聚體，根據調節亞基的差異，I類PI3K被細分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調節亞基，哺乳動物有三個編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數細胞中表達，而其他亞型的表達則有限[3]。
IA類PI3K催化亞基與調節亞基復合形成的p85–p110異二聚體在胞質中保持無活性的狀態。通過p85的SH2結構域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結合，被募集到質膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質底物結合。一項研究通過質譜方法和具有內源性標記IA類亞基的小鼠模型進行實驗表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結合，而p85α優先與p110δ相互作用。同時，該研究還為存在不與p110結合的獨立p85亞基提供了證據[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細胞內鈣釋放相關[5]，還可參與細胞周期調節[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現相反的表達趨勢[7]。
經過前面的介紹，相信大家已經對p85/p-p85蛋白的相關信息和研究有了進一步的了解，在此基礎上，我們也一起來看看，關于WB實驗中p85/p-p85蛋白檢測時可能會遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時，常會遇到這樣的結果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻及數據庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結合p85的結果綜合判斷，如兩組檢測結果均存在50KD附近的條帶，可以認為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設計敲除實驗進行驗證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時會出現僅檢測到55KD條帶的情況，多發生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強，顯影時掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時可變剪切體的磷酸化條帶。這時，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉印后的膜進行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預期不符以外，還可能會出現無條帶的情況，這時我們可以先查詢文獻及數據庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達水平如何。如樣本中靶標蛋白的表達量偏低，可以在提取蛋白時進行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達的樣本同時進行WB檢測，排查是否是樣本原因導致了無信號的結果，還可以更換免疫位點不同的抗體進行實驗，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進行實驗時，建議保留完整的膜進行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當，導致目的蛋白丟失，影響實驗結果。
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[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
PI3Ks是一個脂質激酶家族，可以通過磷酸化細胞內肌醇脂質來調節信號傳導和細胞內小泡運輸。哺乳動物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產生3-磷酸肌醇脂質，其直接激活信號轉導途徑。除了在癌癥中經常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發性免疫疾病中也發現了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內吞途徑、內體循環和自噬中膜交通的調節因子，通常對細胞信號傳導具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調控亞基復合的異二聚體，根據調節亞基的差異，I類PI3K被細分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調節亞基，哺乳動物有三個編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數細胞中表達，而其他亞型的表達則有限[3]。
Fig.1 I類PI3K的IA類結構示意圖
IA類PI3K催化亞基與調節亞基復合形成的p85–p110異二聚體在胞質中保持無活性的狀態。通過p85的SH2結構域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結合，被募集到質膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質底物結合。一項研究通過質譜方法和具有內源性標記IA類亞基的小鼠模型進行實驗表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結合，而p85α優先與p110δ相互作用。同時，該研究還為存在不與p110結合的獨立p85亞基提供了證據[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細胞內鈣釋放相關[5]，還可參與細胞周期調節[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現相反的表達趨勢[7]。
經過前面的介紹，相信大家已經對p85/p-p85蛋白的相關信息和研究有了進一步的了解，在此基礎上，我們也一起來看看，關于WB實驗中p85/p-p85蛋白檢測時可能會遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時，常會遇到這樣的結果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻及數據庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結合p85的結果綜合判斷，如兩組檢測結果均存在50KD附近的條帶，可以認為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設計敲除實驗進行驗證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時會出現僅檢測到55KD條帶的情況，多發生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強，顯影時掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時可變剪切體的磷酸化條帶。這時，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉印后的膜進行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預期不符以外，還可能會出現無條帶的情況，這時我們可以先查詢文獻及數據庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達水平如何。如樣本中靶標蛋白的表達量偏低，可以在提取蛋白時進行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達的樣本同時進行WB檢測，排查是否是樣本原因導致了無信號的結果，還可以更換免疫位點不同的抗體進行實驗，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進行實驗時，建議保留完整的膜進行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當，導致目的蛋白丟失，影響實驗結果。
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產品貨號 |
產品名稱 |
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PI3 Kinase p85 Antibody |
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PI3 Kinase p85(19H8) Rabbit mAb |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199) Antibody |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199)(E3U1H) Rabbit mAb |
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PI3 Kinase p55 (D2B3) Rabbit mAb |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Monoclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Recombinant Monoclonal Antibody(R108) |
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Rabbit anti-Phospho-PI3-kinase p85-α(Tyr607) Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3K p85 α(pY467/199) Polyclonal Antibody |
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Mouse anti-PI 3 Kinase p85α Monoclonal Antibody |
參考文獻：
[1] Miller MS, Thompson PE, Gabelli SB. Structural Determinants of Isoform Selectivity in PI3K Inhibitors. Biomolecules. 2019 Feb 26;9(3):82. doi: 10.3390/biom9030082. PMID: 30813656; PMCID: PMC6468644.[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
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