TR‑FRET、THUNDER檢測技術在PROTAC藥物研發中的應用
近年來，生物醫藥領域風起云涌，一種名為PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）的新型藥物研發策略引起了廣泛關注，被譽為“顛覆傳統的小分子藥物模式”。那么，PROTAC究竟是什么？它與傳統藥物有何不同？目前處于什么樣的發展階段？本文將為你一一解讀。
一、PROTAC
PROTAC，全稱為“蛋白降解靶向嵌合體”，是一種基于細胞內天然蛋白質降解機制的創新型小分子藥物設計策略。
它的結構由三個部分組成：
靶蛋白配體（warhead）：能夠選擇性結合目標蛋白；
E3連接酶配體（ligand）：能結合泛素-蛋白酶體系統中的E3泛素連接酶；
連接臂（linker）：將兩者連接起來。
通過將這兩個配體連接在一起，PROTAC分子能將靶蛋白“送”到細胞的降解機器——泛素-蛋白酶體系統（UPS）中去泛素化降解，從而在系統水平上調控蛋白質的穩態。
圖：基于小分子的PROTAC示意圖
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
迄今為止，已有 30 多種對疾病發展至關重要的蛋白質成為靶向，其中主要致力于癌癥治療的蛋白質。靶向蛋白包括核受體（ER、AR 和 RAR）、蛋白激酶（Akt、BCR-Abl、c-Abl、BTK、ALK、CDK9、RIPK2、DAPK1 和 PSD-95）、轉錄調控蛋白（BRD4、Sirt2、HDAC6、TRIM24、IKZF1/3 和 Smad3）、調節蛋白（CRABP-I/II、TACC3、AHR、FKBP12、ERRα 和 X-protein）、神經退行性相關蛋白（Huntingtin、Tau、α-synuclein和 PSD-95）、細胞代謝酶（MetAP-2 和 DHODH）、 和融合蛋白（Halo tags）。
圖：靶向蛋白、靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和E3泛素連接酶的總覽
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
二、PROTAC主要優勢
傳統小分子藥物的模式是“占位”——它們與靶點結合，抑制其活性。但這通常只適用于“有活性位點”的蛋白，很多被稱為“不可成藥靶點”（undruggable targets）的蛋白，因為缺乏合適結合位點，難以被傳統藥物“拿下”。
而PROTAC則是“破壞”策略。它不需要永久結合目標蛋白，僅需要暫時結合并引導其降解。一旦目標蛋白被降解，PROTAC分子可以“游走”去招募下一個目標。
那么，PROTAC的關鍵優勢就有：
- 攻克“不可成藥靶點”：PROTAC可以降解那些難以抑制的蛋白，如轉錄因子、結構蛋白等。
- 持續時間長、用量低：由于其可重復使用的機制，PROTAC往往具有更持久的藥效。
- 減少耐藥性：傳統抑制劑常因突變產生耐藥性，而PROTAC通過降解可減少這一問題。
- 選擇性更強：通過設計linker和配體結構，PROTAC可以獲得更高的靶點選擇性。
三、PROTAC研發進展
自PROTAC概念首次提出以來，技術不斷成熟。如今，全球已有多款PROTAC候選藥物進入臨床試驗階段，靶點涵蓋癌癥、炎癥、自身免疫疾病等多個領域。
1．TRD209（SHP2靶向PROTAC降解劑）：
由北京泰德制藥研發，成功破解“不可成藥”的SHP2靶點，進入藥物開發階段，對急性髓系白血病（AML）和小細胞肺癌（SCLC）表現出開發潛力。
2．ARV‑471（雌激素受體降解劑）：
由 Arvinas與輝瑞合作開發，目前處于 III 期臨床研究，獲FDA快速通道資格，專注治療ER+/HER2−乳腺癌。
3．BMS‑986365（AR靶點）：
Celgene啟動了 III 期臨床試驗，針對去勢抵抗性轉移性前列腺癌（mCRPC），共有約 960例患者參與。
4．ARV‑102（LRRK2靶向降解劑）：
Arvinas發布首個人體臨床結果，在健康志愿者中安全耐受性良好，有效降低中樞與外周LRRK2水平，為神經退行性疾病提供新的療法。
雖然前景廣闊，但PROTAC也面臨不少挑戰：
1. 分子量大、口服性差：PROTAC通常較大，影響口服生物利用度 。
2. 藥代動力學復雜：在體內的穩定性、分布等仍需優化 。
3. E3連接酶數量有限：目前常用的E3酶較少（如VHL、CRBN），限制靶點拓展。
4. 免疫原性與安全性：長期降解特定蛋白可能影響正常生理過程 。
“分子膠（molecular glue）”等相關技術也在蓬勃發展，與PROTAC一起，共同推動新一代“降解型藥物”平臺的興起。不可否認的是，靶向蛋白降解已經成為新藥研發最炙手可熱的方向之一，值得科研界與產業界持續關注。
四、TR‑FRET 技術在 PROTAC 研發中的應用：
TR‑FRET（Time‑Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一種高靈敏的檢測技術，用于檢測PROTAC三元復合物結合。TR‑FRET 可一次性對PROTAC與靶蛋白、E3連接酶結合活性進行評估，無需多個分開試驗，在篩選效率和成本上具備優勢。
TR‑FRET 技術應用廣泛，可快速轉至其他靶標（如不同 BRDs）而無需更改 assay 條件，具備良好的模塊化特性。
（一）PROTAC三元復合物結合
以GSPT1/CRBN三元結合為例
CC-885是一種新型的cereblon分子膠調節劑，它通過與cereblon (CRBN) 結合，利用CRL4CRBN E3泛素連接酶的功能，發揮抗腫瘤活性。其主要靶點是翻譯終止因子GSPT1，CC-885能夠促進GSPT1的CRBN依賴性泛素化和降解，從而在患者來源的急性髓系白血病腫瘤細胞中表現出高度敏感性，顯示出其臨床潛力。該實驗用Europium-labeled Tag1和Acceptor-labeled Tag2檢測CRBN/DDB1蛋白和GSPT1蛋白通過分子膠CC-885介導的相互作用。
圖左CRBN與GSPT1檢測原理圖；圖右CC-885介導CRBN與GSPT1結合曲線
其他應用實例包括 HDAC10 的 TR‑FRET 配體置換分析，可無需酶促底物，直接評估結合活性，為非傳統靶標提供實驗路徑。
優寧維提供HDAC10 ELISA檢測試劑盒（貨號：abs551208-96T），采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有Histone deacetylase 10 （HDAC10）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP 酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶（HRP）的催化下轉化成藍色并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Histone deacetylase 10 （HDAC10）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。檢測范圍：78.1-5000pg/mL。
技術原理
THUNDER檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與兩個蛋白結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與結合的蛋白濃度成正比，可直接監測三元復合物形成，也便于測定結合動力學指標。全程僅需1h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
使用Bioauxilium 提供的Toolbox試劑進行實驗的可能方案（如下圖），是蛋白質A和蛋白質B之間的相互作用實驗 的一些不同的實驗組合。舉例說明，蛋白質A帶有Tag-a標簽，蛋白質B可以是天然的（圖A），或者將蛋白質B進行生物素化（圖 B），或帶有Tag-b（圖C），或者將蛋白質B直接進行受體或供體標記（圖D）。這幾種示例中，兩種蛋白的標簽或標記都可以互換使用。
圖：蛋白質A和蛋白質B相互作用實驗方案
圖A，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，并使用帶有受體標記的抗蛋白質B抗體（定制或用用標記試劑標記）結合蛋白質B，產生FRET信號。
圖B，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，用受體標記的鏈霉親和素結合生物素化的蛋白質B產生FRET信號。
圖C，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，并使用帶有受體標記的抗Tag-b抗體結合蛋白質B，產生FRET信號。
圖D，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，直接將蛋白質B進行受體標記，產生FRET信號。
下游實驗檢測
PROTAC藥物研發下游實驗涉及細胞因子、磷酸化蛋白的檢測，TR-FRET可以快速篩選潛在候選分子，助力科學實驗。
（1）細胞因子&生物標志檢測
Human IFNγ 為例
THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的IFNγ抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中IFNγ結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與IFNγ濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
Human IFNγ檢測范圍：32 – 30,000 pg/mL
圖：Human IFNγ檢測原理，流程及標曲
（2）磷酸化蛋白檢測
THUNDER磷酸化蛋白和總蛋白檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的蛋白抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中目標蛋白結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與目標蛋白濃度成正比。以磷酸化ERK為例，全程僅需4.5h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測原理示意圖
該試劑盒已通過驗證，適用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴細胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相對定量。用EGF處理HEK293細胞（50000個細胞/孔）與不同梯度濃度的EGF在室溫下孵育10分鐘。數據顯示，EGF促進ERK磷酸化。饑餓處理不同密度的H358細胞18個小時，用不同梯度濃度的RMC-4550在37℃下孵育60分鐘。數據顯示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。用不同梯度濃度的L779,450處理不同密度的MCF7細胞，在37℃下孵育30分鐘。數據顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。在不含血清的RPMI中重懸不同密度的B淋巴細胞，用不同梯度濃度的L779,450在室溫下孵育30分鐘。數據顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。
圖. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗證數據
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