端粒酶檢測方法和應用場景

2009年10月5日,美國科學家伊麗莎白·布萊克本、卡蘿爾·格雷德和杰克·紹斯塔克因“發現端粒和端粒酶是如何保護染色體的”,而獲得2009年諾貝爾生理學或醫學獎。端粒和端粒酶是當今生物界熱門的研究領域之一。研究端粒酶能揭示生物體胚胎早期發育、衰老和癌癥發生的機制。
 
一、端粒和端粒酶的結構和功能
 
端粒(Telomere)是一種位于真核生物染色體末端的特殊結構，能維持染色體末端穩定，避免DNA發生降解、修飾、基因錯誤重組和丟失。端粒是一段結構富含鳥嘌呤的DNA序列及與之結合的蛋白質的復合體。端粒DNA由一系列串聯TTAGGG重復序列構成,真核生物的端粒序列拷貝重復數目和長度因物種而異，長度約3~20kb不等。端粒的DNA序列呈環狀結構即D環--T環結構。
 
端粒隨著細胞分裂的增加而逐漸磨損，長度縮短至臨界值時，細胞停止分裂進入衰老狀態，直至死亡。絕大多數端粒的長度隨分裂次數的增加而逐漸縮短。在一些少數細胞如生殖細胞、干細胞、癌細胞端粒長度保持不變。
 
端粒功能的維持主要由端粒酶 (Telomerase )完成。端粒酶是一種特異核酸蛋白質復合物逆轉錄酶，由互補于端粒DNA的RNA亞基、端粒酶催化亞基及端粒酶相關蛋白組成。人類細胞中主要由RNA模板(TER)，逆轉錄酶(hTERT)和輔助蛋白(TERP1)等三個組分構成，具有逆轉錄酶活性和功能，分子量約為500~1500KDa,其中hTERT能夠促進產生高活性端粒酶全酶,能夠利用自身的RNA模板逆轉錄合成端粒含有TTAGGG重復序列的DNA片段,在端粒酶活性及端粒長度維持中起到決定性作用。
 
端粒酶的活性與腫瘤的發生密切相關,進而影響細胞衰老與凋亡。端粒酶可以作為重要的靶點在對于癌癥的診斷、治療方面發揮作用。
 
正常人體細胞內端粒酶蛋白表達和活性通常處于較低水平，因此每次分裂都會發生端粒(DNA)損耗性縮短,細胞進入衰老和凋亡階段。而癌細胞則可通過各種機制重新激活端粒酶來維持端粒延長，進而導致細胞不斷分裂、增殖。研究發現約有80%以上的癌變細胞能重新激活或上調端粒酶表達維持端粒(DNA)延伸。在正常人的體細胞中,端粒酶處于抑制的狀態,研究發現在包括胃癌、乳腺癌、結腸癌等大多數癌癥細胞中,端粒酶的活性明顯高于正常水平｡關于端粒酶又有新的分子功能發現，即端粒酶調控細胞重編程。
 
二、端粒酶檢測方法
 
端粒酶活性檢測在癌癥的診療等方面具有重大的研究意義｡如何準確､靈敏､快速地獲得端粒酶活性成為了在臨床診斷和治療方面的一大熱點｡
經典的方法是基于鏈式聚合反應(PCR)的端粒酶重復序列擴增技術(TRAPs)法，以后的很多關于端粒酶活性的研究方法均基于PCR技術提出,使得該方法在靈敏度和特異性方面取得了較大的提高。包括端粒重復擴增法(TRAP),TRAP-酶聯免疫吸附(ELISA)法,TRAP-銀染法等等，化學反應發光法、電化學法、熒光分析法、比色法等檢測方法相繼被開發｡
翼和生物開發的端粒酶檢測試劑盒能很好的完成端粒酶活性檢測。原理是：TERT被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關。 因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。具體是采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內參基因GAPDH。通過提取細胞RNA，利用特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應，以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應 (雙重探針：FAM、Cy5)。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達。
 
該試劑盒具有以下特點：
1 . 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2 . 穩定：全程閉管操作，無交叉污染。
3 . 可靠：含內參基因，避免假陰性。
4 . 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5.  定量： 以CT值判斷，可定量檢測。

三、端粒酶檢測應用場景
 
端粒酶檢測可應用于癌癥相關疾病風險評估和用于評估細胞狀態等多種場景，如：
 

1. 人源干細胞端粒酶活性排查
2. 判斷誘導分化是否完全
3. 樣本是否含有未分化種子細胞
4. 成瘤性評估
5. 種子細胞分化殘留檢測