Nature分享：BindCraft開源工具破解蛋白質(zhì)結(jié)合劑設(shè)計(jì)難題

文章來源公眾號(hào)：Drug AI        作者：Drug AI

未來，或許只需輸入靶標(biāo)結(jié)構(gòu)，就能在幾天內(nèi)獲得具備臨床潛力的功能分子

在生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）是調(diào)控生命活動(dòng)的核心機(jī)制，而設(shè)計(jì)能特異性靶向并調(diào)控PPIs的蛋白質(zhì)結(jié)合劑，一直是開發(fā)治療藥物、診斷工具與分子生物學(xué)試劑的關(guān)鍵方向。傳統(tǒng)方法如免疫接種、抗體庫(kù)篩選或定向進(jìn)化，不僅耗時(shí)費(fèi)力，還難以精準(zhǔn)控制結(jié)合位點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)成功率常低于0.1%。即便近年來興起的計(jì)算設(shè)計(jì)方法，如基于Rosetta的物理模擬或結(jié)合RFdiffusion與ProteinMPNN的深度學(xué)習(xí)策略，仍存在 backbone生成與功能界面設(shè)計(jì)脫節(jié)、依賴高通量篩選等局限。

近期，EPFL×MIT團(tuán)隊(duì)在《Nature》發(fā)表的題為“One-shot design of functional protein binders with BindCraft”的研究，提出了一款名為BindCraft的開源自動(dòng)化設(shè)計(jì)流程，徹底改變了這一局面。該工具以AlphaFold2（AF2）為核心驅(qū)動(dòng)，無需高通量篩選或?qū)嶒?yàn)優(yōu)化，就能從頭設(shè)計(jì)出納米摩爾級(jí)親和力的蛋白質(zhì)結(jié)合劑，實(shí)驗(yàn)成功率高達(dá)10%~100%，即便在未知結(jié)合位點(diǎn)的情況下仍能高效工作。

一、BindCraft：為何能突破傳統(tǒng)設(shè)計(jì)的“死穴”？

傳統(tǒng)計(jì)算設(shè)計(jì)方法的核心痛點(diǎn)，在于難以兼顧“結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性”與“功能有效性”——要么依賴固定靶標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)定義支架對(duì)接，導(dǎo)致界面兼容性差；要么在backbone生成后難以精準(zhǔn)優(yōu)化功能界面。BindCraft的創(chuàng)新之處，在于直接將AF2的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)能力融入設(shè)計(jì)全過程，通過反向傳播（backpropagation）實(shí)現(xiàn)結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)、序列與界面協(xié)同優(yōu)化，而非僅將AF2作為后續(xù)篩選工具。

其設(shè)計(jì)流程可概括為三大核心步驟：首先，基于AF2多聚體模型（AF2 multimer）初始化結(jié)合劑設(shè)計(jì)。由于AF2 multimer經(jīng)蛋白質(zhì)復(fù)合物數(shù)據(jù)訓(xùn)練，能更精準(zhǔn)模擬PPIs，相比單體模型可生成更大（平均大20%）、環(huán)結(jié)構(gòu)占比更高且置信度更強(qiáng)的結(jié)合界面。設(shè)計(jì)初始階段，BindCraft會(huì)以隨機(jī)序列啟動(dòng)結(jié)合劑“幻覺生成”（hallucination），通過AF2網(wǎng)絡(luò)計(jì)算設(shè)計(jì)損失（design loss），該損失函數(shù)整合了結(jié)合劑置信度（pLDDT）、界面置信度（i_pTM）、預(yù)測(cè)對(duì)齊誤差（pAE）、殘基接觸等9項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，確保設(shè)計(jì)既符合結(jié)構(gòu)合理性，又滿足功能需求。

其次，通過多階段序列優(yōu)化提升結(jié)合劑的可溶性與穩(wěn)定性。AF2幻覺生成的序列雖能保證界面結(jié)合活性，但常存在表達(dá)量低的問題。為此，BindCraft引入MPNNsol（一種消息傳遞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)），在保持結(jié)合界面完整的前提下，對(duì)結(jié)合劑的核心與表面序列進(jìn)行優(yōu)化——這一步既能保留關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，又能改善蛋白質(zhì)的可溶性與表達(dá)效率，解決了此前AF2幻覺蛋白“難表達(dá)”的共性問題。

最后，通過嚴(yán)格的多維度篩選確保設(shè)計(jì)質(zhì)量。優(yōu)化后的序列會(huì)經(jīng)AF2單體模型重新預(yù)測(cè)（避免多聚體模型對(duì)PPIs的預(yù)測(cè)偏倚），再結(jié)合Rosetta的物理基于評(píng)分（如界面形狀互補(bǔ)性、氫鍵數(shù)量等），最終篩選出pLDDT>0.8、i_pTM>0.5、界面氫鍵>3等滿足嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)。整個(gè)流程完全自動(dòng)化，用戶僅需提供靶標(biāo)PDB結(jié)構(gòu)與基本設(shè)計(jì)參數(shù)（如結(jié)合劑長(zhǎng)度范圍），無需專業(yè)計(jì)算背景即可操作，真正實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)結(jié)合劑設(shè)計(jì)的“民主化”。

值得注意的是，BindCraft還解決了傳統(tǒng)設(shè)計(jì)的另一大局限——靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的“剛性依賴”。此前如RFdiffusion等方法需固定靶標(biāo)backbone，而BindCraft在每輪設(shè)計(jì)迭代中都會(huì)重新預(yù)測(cè)結(jié)合劑-靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，允許靶標(biāo)與結(jié)合劑的側(cè)鏈和backbone存在一定靈活性（靶標(biāo)backbone的Cα RMSD可在0.5~5.5 Å范圍內(nèi)調(diào)整），最終形成的結(jié)合界面能更精準(zhǔn)地“貼合”靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，這也是其能在未知結(jié)合位點(diǎn)場(chǎng)景下工作的關(guān)鍵。

圖1. 基于 BindCraft 的從頭結(jié)合劑設(shè)計(jì)流程與靶標(biāo)概況。a 部分為 BindCraft 結(jié)合劑設(shè)計(jì)流程的示意圖，展示了從靶標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輸入到最終篩選獲得優(yōu)化設(shè)計(jì)的完整步驟 —— 首先利用 AF2 多聚體模型生成結(jié)合劑的骨架與序列，接著在保持界面完整的前提下，通過 MPNN 對(duì)結(jié)合劑的表面和核心序列進(jìn)行優(yōu)化，最后基于 AF2 單體模型預(yù)測(cè)結(jié)果篩選出高質(zhì)量設(shè)計(jì)；b 部分為結(jié)合劑設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)概覽，標(biāo)注了各類靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)特征（綠色為設(shè)計(jì)時(shí)使用的區(qū)域，灰色為排除區(qū)域）、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的成功結(jié)合劑數(shù)量（藍(lán)色框內(nèi)，分子結(jié)合通過 SPR 檢測(cè)）及最高親和力結(jié)合劑的解離常數(shù)（Kd，黃色框?yàn)閷?shí)測(cè)值，橙色框?yàn)橐驍M合效果差的估算值），涵蓋細(xì)胞表面受體（如 PD-L1、PD-1）、常見過敏原（如 BetV1、DerF21）、多結(jié)構(gòu)域核酸酶（如 SpCas9）等 12 類挑戰(zhàn)性靶標(biāo)，其中 PD-1 結(jié)合劑以雙價(jià) Fc 融合形式測(cè)試，部分靶標(biāo)最低 Kd 可達(dá) < 1 nM，直觀體現(xiàn)了 BindCraft 在不同類型靶標(biāo)上的設(shè)計(jì)效率與親和力水平。

二、12類挑戰(zhàn)性靶標(biāo)驗(yàn)證：從細(xì)胞表面受體到核酸結(jié)合蛋白

一款蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)工具的價(jià)值，最終需通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其普適性與功能性。BindCraft團(tuán)隊(duì)選擇了12類具有重要生物學(xué)與治療意義的靶標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，涵蓋細(xì)胞表面受體、常見過敏原、從頭設(shè)計(jì)蛋白及多結(jié)構(gòu)域核酸酶（如CRISPR-Cas9），每類靶標(biāo)的設(shè)計(jì)結(jié)果都令人驚喜。

1. 細(xì)胞表面受體：精準(zhǔn)靶向免疫檢查點(diǎn)與未知位點(diǎn)

細(xì)胞表面受體是免疫治療的核心靶標(biāo)，但傳統(tǒng)抗體設(shè)計(jì)常受限于已知結(jié)合位點(diǎn)。BindCraft針對(duì)PD-1（免疫檢查點(diǎn)受體）設(shè)計(jì)的53個(gè)結(jié)合劑中，13個(gè)表現(xiàn)出結(jié)合活性，最優(yōu)結(jié)合劑以雙價(jià)Fc融合形式存在時(shí)，表觀解離常數(shù)（Kd*）<1 nM，且與臨床藥物 pembrolizumab（帕博利珠單抗）競(jìng)爭(zhēng)相同結(jié)合位點(diǎn)——這意味著其有望成為PD-1抑制劑的替代候選分子，且分子量更小（60~240個(gè)氨基酸），可能具備更好的組織穿透性。

更值得關(guān)注的是，BindCraft對(duì)“無已知結(jié)合位點(diǎn)”靶標(biāo)的設(shè)計(jì)能力。以CD45為例，其胞外域含4個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域且高度糖基化，傳統(tǒng)方法難以定位結(jié)合位點(diǎn)。BindCraft設(shè)計(jì)的16個(gè)結(jié)合劑中，4個(gè)通過SPR驗(yàn)證，最優(yōu)結(jié)合劑（binder1）親和力達(dá)14.7 nM，且精準(zhǔn)靶向d3與d4結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)域——這一結(jié)果證明，BindCraft無需依賴已知結(jié)合位點(diǎn)信息，僅通過靶標(biāo)結(jié)構(gòu)即可“自主”發(fā)現(xiàn)功能性結(jié)合區(qū)域，為難成藥受體的靶向提供了新策略。

圖2. 針對(duì)細(xì)胞表面受體的結(jié)合劑設(shè)計(jì)與功能驗(yàn)證。a 為 binder2 與 PD-1 復(fù)合物的設(shè)計(jì)模型，b 為 BLI 傳感器圖顯示 binder2（雙價(jià) Fc 融合形式）與 PD-1 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，其 Kd*≤1 nM；c 為 binder4 與 PD-L1 的設(shè)計(jì)模型，d 為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd*=615 nM）；e 為 binder5 與 IFNAR2 的設(shè)計(jì)模型，f 為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd=260 nM）；g 為 binder1 與 CD45 的設(shè)計(jì)模型，h 為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd=14.7 nM）；i 為基于 CpE 的細(xì)胞毒性及 CLDN1 結(jié)合劑抑制機(jī)制的示意圖；j 為 SPR 單循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析顯示 CLDN1 結(jié)合劑 12 與可溶性 CLDN1 類似物的結(jié)合；k 為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明 CLDN1 結(jié)合劑 9、12 能以濃度依賴方式抑制 CpE 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，效果與已知 CpE 抑制劑相當(dāng)；l 為 MST 測(cè)定顯示結(jié)合劑 12 可阻斷 CpE 與 CLDN1 WT 的結(jié)合，驗(yàn)證了結(jié)合劑與 CpE 競(jìng)爭(zhēng)相同結(jié)合位點(diǎn)的機(jī)制，全面證明了 BindCraft 設(shè)計(jì)的細(xì)胞表面受體結(jié)合劑在結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性、結(jié)合親和力及功能調(diào)控上的有效性。

2. 過敏原：從結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)到臨床樣本驗(yàn)證的“抗過敏”潛力

過敏原是一類極具挑戰(zhàn)性的設(shè)計(jì)靶標(biāo)——其表面多帶高電荷，且傳統(tǒng)認(rèn)為疏水性結(jié)合位點(diǎn)更易設(shè)計(jì)，而過敏原的親水性表面常導(dǎo)致設(shè)計(jì)失敗。BindCraft針對(duì)塵螨過敏原Der f7、Der f21及樺樹主要過敏原Bet v1（引發(fā)95%樺樹相關(guān)過敏）的設(shè)計(jì)，打破了這一認(rèn)知。

針對(duì)Bet v1，BindCraft設(shè)計(jì)的7個(gè)結(jié)合劑中2個(gè)有效，最優(yōu)結(jié)合劑（binder2）親和力達(dá)120 nM，且能與臨床候選抗體混合物（REGN5713/5714/5715）競(jìng)爭(zhēng)相同表位。更關(guān)鍵的是，在患者血清樣本中，該結(jié)合劑能阻斷Bet v1與IgE的結(jié)合，最高阻斷率達(dá)50%——這一結(jié)果與單克隆抗體的阻斷效果相當(dāng)，且結(jié)合劑穩(wěn)定性更高，為過敏性疾病的“精準(zhǔn)中和”提供了新方案。此外，針對(duì)Der f7的結(jié)合劑（binder2）還通過晶體結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，其backbone與設(shè)計(jì)模型的RMSD僅1.7 Å，證明了BindCraft設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性。

圖3. 阻斷常見過敏原表位的結(jié)合劑設(shè)計(jì)。a 左側(cè)為針對(duì)塵螨過敏原 Der f7 的 binder2 設(shè)計(jì)模型，右側(cè)為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd=12.8 nM）；b 為 Der f7-binder2 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（彩色）與設(shè)計(jì)模型（灰色）疊加圖，驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性；c 左側(cè)為針對(duì)塵螨過敏原 Der f21 的 binder10 設(shè)計(jì)模型，右側(cè)為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd*=793 nM）；d 為 Der f21-binder10 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（彩色）與設(shè)計(jì)模型（灰色）疊加圖，因界面酪氨酸的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體構(gòu)象差異，backbone 的 RMSD 為 3.1 Å；e 左側(cè)為針對(duì)樺樹過敏原 Bet v1 的 binder2 設(shè)計(jì)模型，右側(cè)為 SPR 測(cè)定的二者結(jié)合親和力（Kd=120 nM）；f 為 SEC-MALS 分析顯示 Bet v1（藍(lán)色，預(yù)期分子量 18.5 kDa）與 binder2（橙色，預(yù)期分子量 29.3 kDa）形成 1:1 復(fù)合物（實(shí)測(cè)分子量 27.8 kDa）；g 為 Bet v1 與商業(yè)抗 Bet v1 REGN 抗體混合物結(jié)合的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（PDB 7MXL）；h 為競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)證實(shí) binder2 與 REGN5713 抗體靶向 Bet v1 的重疊表位；i 為阻斷 ELISA 實(shí)驗(yàn)顯示，binder2 能像 REGN 抗體混合物一樣，阻止 Bet v1 與樺樹過敏患者血清中 IgE 的結(jié)合，部分患者中阻斷率達(dá) 50%，體現(xiàn)了其抗過敏治療潛力。

3. 多結(jié)構(gòu)域核酸酶：攻克“不可成藥”的核酸結(jié)合界面

核酸結(jié)合蛋白（如CRISPR-Cas9、Argonaute）的界面因大尺寸、高電荷、凸面結(jié)構(gòu)，一直被認(rèn)為是“不可成藥”靶點(diǎn)——小分子難以結(jié)合，傳統(tǒng)抗體又難以穿透核酸結(jié)合通道。BindCraft針對(duì)這類靶標(biāo)的設(shè)計(jì)，首次證明了蛋白質(zhì)結(jié)合劑可有效調(diào)控核酸酶活性。

在SpCas9（CRISPR基因編輯核心工具）的設(shè)計(jì)中，BindCraft靶向其REC1結(jié)構(gòu)域（向?qū)�RNA結(jié)合口袋），6個(gè)測(cè)試結(jié)合劑全部能結(jié)合全長(zhǎng)apo SpCas9，最優(yōu)結(jié)合劑（binder3/10）親和力達(dá)300 nM級(jí)。功能實(shí)驗(yàn)顯示，這些結(jié)合劑能顯著降低HEK293T細(xì)胞中的Cas9基因編輯效率，且抑制效果優(yōu)于天然抗CRISPR蛋白AcrIIC2——這為基因編輯的“精準(zhǔn)調(diào)控”提供了新工具，可有效降低脫靶效應(yīng)。

更令人振奮的是對(duì)Argonaute核酸酶（CbAgo）的設(shè)計(jì)。CbAgo作為細(xì)菌免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，通過小核酸向?qū)�切割外源DNA，但目前尚無天然抑制劑報(bào)道。BindCraft針對(duì)其N-PIWI通道或PAZ結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的12個(gè)結(jié)合劑中，2個(gè)能強(qiáng)效抑制CbAgo的DNA切割活性：加入2 μM binder2后，CbAgo的催化常數(shù)（kcat）從0.004 s⁻¹降至5×10⁻⁵ s⁻¹（降低80倍），且該結(jié)合劑能與CbAgo形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過競(jìng)爭(zhēng)向?qū)�DNA（gDNA）結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用。這一結(jié)果不僅證明BindCraft可設(shè)計(jì)核酸結(jié)合界面的結(jié)合劑，更為開發(fā)新型核酸酶抑制劑提供了范式。

圖4. 針對(duì)核酸引導(dǎo)多結(jié)構(gòu)域核酸酶的從頭結(jié)合劑設(shè)計(jì)。a 為 SpCas9 REC1 結(jié)構(gòu)域與向?qū)?RNA 結(jié)合的局部放大圖（PDB 4ZT0），標(biāo)注了設(shè)計(jì)結(jié)合劑的結(jié)合口袋；b 為 binder3 與 apo 形式 SpCas9 結(jié)合的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，REC1 結(jié)構(gòu)域?yàn)榫G色，其余部分為灰色，疊加了灰色的冷凍電鏡密度；c 為 binder10 與 apo 形式 SpCas9 結(jié)合的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，標(biāo)注方式同 b；d 為 HEK293T 細(xì)胞中 SpCas9 基因編輯效率實(shí)驗(yàn)，顯示設(shè)計(jì)的結(jié)合劑（綠色柱）能顯著降低編輯效率，部分效果優(yōu)于天然抗 CRISPR 蛋白（藍(lán)色柱）；e 為結(jié)合 gDNA 和 tDNA 的 Clostridium butyricum Argonaute（CbAgo）結(jié)構(gòu)示意圖（PDB 6QZK），標(biāo)注了設(shè)計(jì)靶向的 PAZ 結(jié)構(gòu)域及 N+PIWI 結(jié)構(gòu)域；f 為 CbAgo 介導(dǎo)的 tDNA 切割實(shí)驗(yàn)，顯示設(shè)計(jì)的結(jié)合劑（綠色柱）能強(qiáng)效抑制切割活性；g 為時(shí)間依賴性的 CbAgo-gDNA 介導(dǎo)靶 DNA 切割曲線，顯示加入 binder2（粉色線）或 binder3（紫色線）后，切割效率顯著低于無結(jié)合劑組（灰色線），證實(shí)了結(jié)合劑對(duì)核酸酶活性的抑制作用。

三、從“設(shè)計(jì)”到“應(yīng)用”：BindCraft的轉(zhuǎn)化潛力

優(yōu)秀的技術(shù)不僅要解決科學(xué)問題，更要具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。BindCraft團(tuán)隊(duì)在論文中展示了其在基因治療、毒素中和等領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化潛力，其中最具代表性的是腺相關(guān)病毒（AAV）的靶向重定向。

AAV是基因治療的常用載體，但天然AAV靶向性差，常需高劑量給藥，導(dǎo)致脫靶效應(yīng)與免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)AAV重定向方法依賴肽段插入或抗體片段融合，需大量篩選且難以控制結(jié)合位點(diǎn)。BindCraft的解決方案是：設(shè)計(jì)針對(duì)特定細(xì)胞表面受體（如HER2、PD-L1）的迷你蛋白結(jié)合劑，將其插入AAV衣殼的VR-V區(qū)域（經(jīng)突變研究驗(yàn)證的最優(yōu)插入位點(diǎn)），同時(shí)通過突變敲除AAV對(duì)肝素與唾液酸的天然結(jié)合能力，實(shí)現(xiàn)“脫靶-重定向”雙重調(diào)控。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針對(duì)HER2設(shè)計(jì)的結(jié)合劑（binder1）與PD-L1設(shè)計(jì)的結(jié)合劑（binder202），能使AAV特異性靶向表達(dá)HER2或PD-L1的HEK293細(xì)胞， transduction效率最高提升61倍，且當(dāng)加入靶向PD-L1的抗體后，transduction被顯著阻斷——證明結(jié)合劑確實(shí)介導(dǎo)了AAV與靶標(biāo)受體的特異性結(jié)合。這一成果為基因治療的“精準(zhǔn)遞送”提供了新策略，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病相關(guān)細(xì)胞的定向基因?qū)�入，降低系統(tǒng)毒性。

圖5. 通過 AAV 工程實(shí)現(xiàn)靶向基因遞送。該圖呈現(xiàn)了利用 BindCraft 設(shè)計(jì)的結(jié)合劑重定向 AAV 載體以實(shí)現(xiàn)靶向基因遞送的成果：a 為 AAV-cmv-GFP 重定向的示意圖，展示了通過插入細(xì)胞類型受體特異性迷你蛋白結(jié)合劑，替代 AAV 對(duì)細(xì)胞表面聚糖的天然結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶向遞送；b 為重定向 AAV 顆粒的嵌合組裝示意圖，包含天然亞基與插入結(jié)合劑的工程亞基，形成從頭設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用；c 為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同 AAV 變體對(duì) HER2 或 PD-L1 過表達(dá) HEK293 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，標(biāo)注了信號(hào)噪聲比（× 倍），顯示靶向 HER2 和 PD-L1 的 AAV 變體轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性顯著提升，而野生型（WT）和敲除型（KO）AAV 無特異性；d 為針對(duì) HER2 的 binder1 設(shè)計(jì)模型；e 為針對(duì) PD-L1 的 binder202 設(shè)計(jì)模型；f 為熱圖展示不同 AAV 變體在 HER2 或 PD-L1 過表達(dá)細(xì)胞上的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，驗(yàn)證了靶向變體的特異性；g 為 PD-L1 靶向 AAV 的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，直方圖顯示加入抗 PD-L1 抗體后，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著降低，證實(shí)設(shè)計(jì)的結(jié)合劑介導(dǎo)了 AAV 與靶標(biāo)受體的特異性結(jié)合，為精準(zhǔn)基因治療提供了新策略。

BindCraft 設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)模擬分析。該圖通過多維度數(shù)據(jù)對(duì) BindCraft 的設(shè)計(jì)過程與結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證：a 為不同設(shè)計(jì)靶標(biāo)在 AF2 結(jié)合劑幻覺生成后，靶標(biāo)結(jié)構(gòu)相對(duì)于輸入靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的 Cα RMSD 值分布圖，體現(xiàn)了靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的靈活性范圍；b 為螺旋度損失對(duì) PD-L1 結(jié)合劑二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響，負(fù)權(quán)重值（抑制 α- 螺旋形成）可產(chǎn)生純 β- 折疊結(jié)合劑；c 為不同靶標(biāo)和結(jié)合劑長(zhǎng)度下，生成 100 個(gè)通過計(jì)算篩選的結(jié)合劑所需的 GPU 小時(shí)數(shù)，標(biāo)注了需采樣的設(shè)計(jì)數(shù)量，對(duì)比了 BindCraft 與 RFdiffusion 的計(jì)算效率；d 為 BindCraft 與 RFdiffusion 在 PD-L1、IFNAR2、DerF7 和 BBF-14 四個(gè)靶標(biāo)上，結(jié)合劑界面的氨基酸類型分布對(duì)比圖；e 為設(shè)計(jì)的結(jié)合劑折疊結(jié)構(gòu)（綠色）及結(jié)合劑 - 靶標(biāo)界面（粉色）與 PDB 中最相似結(jié)構(gòu)的最大 TM 分?jǐn)?shù)和序列同一性對(duì)比箱線圖，箱線圖中心線為中位數(shù)，箱體為 25%~75% 分位數(shù)，須為最小值和最大值，異常值為超出 1.5 倍四分位距的數(shù)據(jù)點(diǎn)，證實(shí)設(shè)計(jì)結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)與界面新穎性。

四、展望與局限：蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)邁入“按需定制”時(shí)代

BindCraft的出現(xiàn)，標(biāo)志著計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)從“高通量篩選依賴”向“一次設(shè)計(jì)即獲功能分子”邁進(jìn)。其平均46.3%的實(shí)驗(yàn)成功率，遠(yuǎn)超當(dāng)前主流方法（如RFdiffusion約10%~20%），且無需依賴高通量篩選平臺(tái)，使普通實(shí)驗(yàn)室也能開展高質(zhì)量蛋白質(zhì)結(jié)合劑設(shè)計(jì)。但作為研究者，我們也需客觀看待其局限：一是GPU計(jì)算成本較高，反向傳播過程對(duì)硬件要求較高；二是AF2單體模型篩選可能排除部分高親和力結(jié)合劑，且AF2對(duì)單點(diǎn)突變不敏感，需結(jié)合Rosetta等工具進(jìn)一步驗(yàn)證；三是結(jié)合劑的免疫原性與體內(nèi)遞送問題仍需解決——盡管其分子量小于抗體，但合成蛋白的免疫原性仍需在動(dòng)物模型中評(píng)估。

不過，這些局限并非不可克服。隨著AlphaFold3等新一代模型的出現(xiàn)，結(jié)合劑的設(shè)計(jì)精度有望進(jìn)一步提升；而遞送技術(shù)（如納米顆粒、細(xì)胞穿透肽）的發(fā)展，也將助力結(jié)合劑的體內(nèi)應(yīng)用。更重要的是，BindCraft已開源，這意味著研究者可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行二次開發(fā)，推動(dòng)技術(shù)快速迭代。

回顧蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域的發(fā)展，從早期Rosetta的“腳手架設(shè)計(jì)”到如今BindCraft的“協(xié)同優(yōu)化”，我們見證了計(jì)算方法從“輔助篩選”到“主導(dǎo)設(shè)計(jì)”的轉(zhuǎn)變。BindCraft的成果不僅為治療（如抗過敏、基因編輯調(diào)控）、診斷（如特異性探針）與生物技術(shù)（如AAV靶向遞送）提供了新工具，更讓我們看到了“按需定制蛋白質(zhì)結(jié)合劑”的可能性——未來，或許只需輸入靶標(biāo)結(jié)構(gòu)，就能在幾天內(nèi)獲得具備臨床潛力的功能分子。

建議相關(guān)領(lǐng)域的研究者重點(diǎn)關(guān)注這一工具，無論是開發(fā)新型治療藥物，還是探索蛋白質(zhì)相互作用的基本機(jī)制，BindCraft都將成為極具價(jià)值的研究助手。也期待未來能看到更多基于BindCraft的轉(zhuǎn)化研究，讓計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)真正從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。​