肝癌模型Hep G2細胞培養的關鍵技術和常見問題解答
【細胞介紹】
Hep G2 [HEPG2] 是一種表現出上皮樣形態的細胞系，是從一名患有肝癌的阿根廷 15 歲白人男性青年的肝細胞癌中分離出來的。該細胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞系由Wistar研究所獲得，是合適的轉染宿主。表達標志物包括胰島素;胰島素樣生長因子 II （IGF II）。
Hep G2細胞生長特性通常緊密連接成片狀增殖，初期附著于培養瓶壁形成小島狀結構，后期可能出現多層堆積或懸浮狀態。該細胞系因貼壁性強，常用于研究肝細胞功能及病毒模型。以下是中喬新舟拍攝的Hep G2細胞拍攝的在不同放大倍數下的圖片：
4X
10X
20X
細胞名稱：Hep G2人肝癌細胞
細胞別名：HEP-G2; Hep G2; HEP G2; Hep-G2; HEPG2
產品貨號：ZQ0022
生長特性：貼壁生長
培養條件：87%MEM（含NEAA）（貨號：ZQ-300）+10%進口胎牛血清（貨號：ZQ500-S）+1% L-alanyl-L-glutamine（貨號：CSP004）+1%丙酮酸鈉（貨號：CSP003）+1%雙抗（貨號：CSP006）
含血清完全培養基貨號：ZM0022
無血清完全培養基貨號：SFM0022
培養環境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養】
該細胞為貼壁生長：
1、細胞有脫落情況時，將培養液轉移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細胞（漂浮細胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養基，等貼壁細胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細胞表面，放入培養箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細胞無變化繼續放入培養箱消化)一旦細胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細胞開始脫落，當達到70-80%細胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細胞充分解離。
3、將細胞懸液轉移到無菌離心管中，計數，離心收集細胞。用適量完全培養基重懸細胞沉淀，使細胞密度為每毫升0.6-2X105。將細胞懸液轉至培養瓶中，靜置于培養箱中。建議T25培養瓶添加5-7ml完全培養基，以后2-3天進行換液。
【細胞凍存】
1、細胞密度80%以上，活細胞百分率達95%以上時，將細胞按照以上步驟進行消化收集細胞沉淀進行凍存。
2、細胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉移至液氮中保存。
【細胞復蘇】
1、液氮取出的細胞放入干冰中轉移至細胞房，提前準備好完全培養基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內容物轉移到含3-6mL完全培養基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養基， 管底細胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養基至離心管內混勻細胞并進行計數。
4、用適量完全培養基將細胞密度調整至0.6-2.0X105，轉移至培養瓶中，再將瓶轉移至培養箱中靜置培養。T25培養瓶建議添加5-7ml完全培養基。當密度達到80%以上時傳代。
【常見問題】
1、培養過程中細胞碎片較多怎么處理？
1）細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。
2.）細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
2、空泡現象
HepG2細胞中常有空泡，這是該細胞正常特性，不影響細胞生長，無需擔心。
3、細胞生長慢
培養條件適宜的情況下，在T25培養瓶中生長的HepG2細胞，以1:2傳代后，培養2-3天可以到達80%匯合率。若細胞生長過慢甚至不生長，可將血清增加至15%-20%（不要超過20%），待細胞恢復生長速度后再將血清比例降低到10%。
細胞接種密度不可過低，否則生長非常緩慢。
4、細胞聚團或不貼壁
血清品牌和培養基pH是影響HepG2細胞貼壁性的關鍵因素。
通常HepG2細胞呈單層生長，但遇到不合適的血清細胞可能呈現聚集傾向，最終聚團且不易消化開；也可能貼壁性變弱，漂浮細胞變多。使用高質量低內毒素未滅活的胎牛血清，可以幫助細胞更好地貼壁及形成單層細胞。
pH過高過低都將影響細胞貼壁性，每天觀察培養器皿中培養基的顏色，偏黃及時換液，偏紫時檢查培養箱CO2供應是否正常，培養瓶是否透氣，并及時換液。
5、漂浮細胞多
排除上文中提到的血清和pH對細胞貼壁的影響，傳代或復蘇后若有部分細胞漂浮，是正常現象，隨著培養部分漂浮細胞會逐漸貼壁。漂浮細胞較多時不要扔，使用臺盼藍檢查細胞活性，若大部分是活細胞，將這些細胞離心收集后重新接種至原瓶。增加血清量（總比例不超過20%）可以促進貼壁。
消化時需注意時間不能太長，第一次消化該細胞要摸索最佳時間。中和時輕柔吹打，控制吹打次數和力度，可有效減少傳代后漂浮細胞。
6、有圓形細胞粘附在貼壁的單層細胞上
這在HepG2培養時是常見現象，這些細胞可能是尚未完全貼壁或者正處于分裂期的細胞，無需對此特殊處理。
【注意事項】：
1. Hep G2 [HEPG2]對培養條件要求較嚴格，特別是 pH 值和血清質量，否則可能影響細胞凝集數量，應使用高質量低內毒素，未滅火的胎牛血清，可以幫助圓形的細胞叢簇更好的貼壁及形成單層細胞。細胞內容易有空泡，特別是在融合時，這屬于正常現象。
2. 該細胞部分團塊生長，復蘇后可能存在形態不典型的情況，經幾次傳代后，上皮細胞形態會更加典型。
3. 該細胞對血清質量較為敏感，我司建議您使用優質胎牛血清進行培養或選擇訂購我司配套MEM完全培養液。
4.另我司提供Hep G2無血清專用培養基，歡迎咨詢訂購。
【發表過的文獻】
截至到2024年，引用中喬新舟該細胞發表過的文獻總數72篇，總的影響因子467.07，最高影響因子27.5.數據如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻，可以參考：
1.論文題目：Dienediamine: A safe surrogate for the herbicide paraquat
期刊： Molecular Plant 影響因子：27.5
2.論文題目：Photodegradation of carbon dots cause cytotoxicity
期刊：Nature Communications 影響因子：14.919
3.論文題目：Ubiquitin-specific protease 1 facilitates hepatocellular carcinoma progression by modulating mitochondrial fission and metabolic reprogramming via cyclin-dependent kinase 5 stabilization
期刊：CELL DEATH AND DIFFERENTIATION 影響因子：13.7
4.論文題目：Site-specific ubiquitination of VDAC1 restricts its oligomerization and mitochondrial DNA release in liver fibrosis
期刊：EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE 影響因子：12.8
5.論文題目：Accumulation of nanoplastics in human cells as visualized and quantified by hyperspectral imaging with enhanced dark-field microscopy
期刊： ENVIRONMENT INTERNATIONAL 影響因子：11.8
Hep G2 [HEPG2] 是一種表現出上皮樣形態的細胞系，是從一名患有肝癌的阿根廷 15 歲白人男性青年的肝細胞癌中分離出來的。該細胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞系由Wistar研究所獲得，是合適的轉染宿主。表達標志物包括胰島素;胰島素樣生長因子 II （IGF II）。
Hep G2細胞生長特性通常緊密連接成片狀增殖，初期附著于培養瓶壁形成小島狀結構，后期可能出現多層堆積或懸浮狀態。該細胞系因貼壁性強，常用于研究肝細胞功能及病毒模型。以下是中喬新舟拍攝的Hep G2細胞拍攝的在不同放大倍數下的圖片：
4X
10X
20X
細胞名稱：Hep G2人肝癌細胞
細胞別名：HEP-G2; Hep G2; HEP G2; Hep-G2; HEPG2
產品貨號：ZQ0022
生長特性：貼壁生長
培養條件：87%MEM（含NEAA）（貨號：ZQ-300）+10%進口胎牛血清（貨號：ZQ500-S）+1% L-alanyl-L-glutamine（貨號：CSP004）+1%丙酮酸鈉（貨號：CSP003）+1%雙抗（貨號：CSP006）
含血清完全培養基貨號：ZM0022
無血清完全培養基貨號：SFM0022
培養環境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養】
該細胞為貼壁生長：
1、細胞有脫落情況時，將培養液轉移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細胞（漂浮細胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養基，等貼壁細胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細胞表面，放入培養箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細胞無變化繼續放入培養箱消化)一旦細胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細胞開始脫落，當達到70-80%細胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細胞充分解離。
3、將細胞懸液轉移到無菌離心管中，計數，離心收集細胞。用適量完全培養基重懸細胞沉淀，使細胞密度為每毫升0.6-2X105。將細胞懸液轉至培養瓶中，靜置于培養箱中。建議T25培養瓶添加5-7ml完全培養基，以后2-3天進行換液。
【細胞凍存】
1、細胞密度80%以上，活細胞百分率達95%以上時，將細胞按照以上步驟進行消化收集細胞沉淀進行凍存。
2、細胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉移至液氮中保存。
【細胞復蘇】
1、液氮取出的細胞放入干冰中轉移至細胞房，提前準備好完全培養基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內容物轉移到含3-6mL完全培養基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養基， 管底細胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養基至離心管內混勻細胞并進行計數。
4、用適量完全培養基將細胞密度調整至0.6-2.0X105，轉移至培養瓶中，再將瓶轉移至培養箱中靜置培養。T25培養瓶建議添加5-7ml完全培養基。當密度達到80%以上時傳代。
【常見問題】
1、培養過程中細胞碎片較多怎么處理？
1）細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。
2.）細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
2、空泡現象
HepG2細胞中常有空泡，這是該細胞正常特性，不影響細胞生長，無需擔心。
3、細胞生長慢
培養條件適宜的情況下，在T25培養瓶中生長的HepG2細胞，以1:2傳代后，培養2-3天可以到達80%匯合率。若細胞生長過慢甚至不生長，可將血清增加至15%-20%（不要超過20%），待細胞恢復生長速度后再將血清比例降低到10%。
細胞接種密度不可過低，否則生長非常緩慢。
4、細胞聚團或不貼壁
血清品牌和培養基pH是影響HepG2細胞貼壁性的關鍵因素。
通常HepG2細胞呈單層生長，但遇到不合適的血清細胞可能呈現聚集傾向，最終聚團且不易消化開；也可能貼壁性變弱，漂浮細胞變多。使用高質量低內毒素未滅活的胎牛血清，可以幫助細胞更好地貼壁及形成單層細胞。
pH過高過低都將影響細胞貼壁性，每天觀察培養器皿中培養基的顏色，偏黃及時換液，偏紫時檢查培養箱CO2供應是否正常，培養瓶是否透氣，并及時換液。
5、漂浮細胞多
排除上文中提到的血清和pH對細胞貼壁的影響，傳代或復蘇后若有部分細胞漂浮，是正常現象，隨著培養部分漂浮細胞會逐漸貼壁。漂浮細胞較多時不要扔，使用臺盼藍檢查細胞活性，若大部分是活細胞，將這些細胞離心收集后重新接種至原瓶。增加血清量（總比例不超過20%）可以促進貼壁。
消化時需注意時間不能太長，第一次消化該細胞要摸索最佳時間。中和時輕柔吹打，控制吹打次數和力度，可有效減少傳代后漂浮細胞。
6、有圓形細胞粘附在貼壁的單層細胞上
這在HepG2培養時是常見現象，這些細胞可能是尚未完全貼壁或者正處于分裂期的細胞，無需對此特殊處理。
【注意事項】：
1. Hep G2 [HEPG2]對培養條件要求較嚴格，特別是 pH 值和血清質量，否則可能影響細胞凝集數量，應使用高質量低內毒素，未滅火的胎牛血清，可以幫助圓形的細胞叢簇更好的貼壁及形成單層細胞。細胞內容易有空泡，特別是在融合時，這屬于正常現象。
2. 該細胞部分團塊生長，復蘇后可能存在形態不典型的情況，經幾次傳代后，上皮細胞形態會更加典型。
3. 該細胞對血清質量較為敏感，我司建議您使用優質胎牛血清進行培養或選擇訂購我司配套MEM完全培養液。
4.另我司提供Hep G2無血清專用培養基，歡迎咨詢訂購。
【發表過的文獻】
截至到2024年，引用中喬新舟該細胞發表過的文獻總數72篇，總的影響因子467.07，最高影響因子27.5.數據如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻，可以參考：
1.論文題目：Dienediamine: A safe surrogate for the herbicide paraquat
期刊： Molecular Plant 影響因子：27.5
2.論文題目：Photodegradation of carbon dots cause cytotoxicity
期刊：Nature Communications 影響因子：14.919
3.論文題目：Ubiquitin-specific protease 1 facilitates hepatocellular carcinoma progression by modulating mitochondrial fission and metabolic reprogramming via cyclin-dependent kinase 5 stabilization
期刊：CELL DEATH AND DIFFERENTIATION 影響因子：13.7
4.論文題目：Site-specific ubiquitination of VDAC1 restricts its oligomerization and mitochondrial DNA release in liver fibrosis
期刊：EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE 影響因子：12.8
5.論文題目：Accumulation of nanoplastics in human cells as visualized and quantified by hyperspectral imaging with enhanced dark-field microscopy
期刊： ENVIRONMENT INTERNATIONAL 影響因子：11.8
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