葡萄糖氧化酶K-GLOX檢測試劑盒使用說明書
葡萄糖氧化酶K-GLOX
（200 次手動檢測/盒）或
（1960 次自動分析儀檢測/盒）或
（2000 次微孔板檢測/盒）
產品介紹：
葡萄糖氧化酶（GOX）催化β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-內酯和過氧化氫。葡萄糖氧化酶對β-D-葡萄糖具有高度特異性，對α-D-葡萄糖完全沒有催化活性。葡萄糖氧化酶的主要用途之一是測定體液、食品和農產品中的游離葡萄糖含量。它也是一種常用烘焙添加劑，用于增加面筋強度。在一些應用中也可用于替代傳統的氧化劑，例如溴酸鹽和 L-抗壞血酸。葡萄糖氧化酶的其他用途包括去除食品包裝袋內的氧氣和去除蛋清中的 D-葡萄糖以防止發生褐變反應。
原理：
葡萄糖氧化酶催化 β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-內酯，并釋放過氧化氫（H2O2）（1）。在過氧化物酶（POD）的作用下，過氧化氫與對羥基苯甲酸和 4-氨基安替比林反應，定量生成醌亞胺染料。測定醌亞胺染料在 510 nm 波長下的吸光度值（2）。
檢測涉及的反應如下：
試劑盒：
試劑盒：
紐勤提供可進行 200 次手動檢測（或 1960 次自動分析儀檢測或 2000 次微孔板檢測）的試劑盒。該試劑盒包含完整的檢測方法以及：
1 號瓶：（x2）
緩沖液（12 mL，pH 7.0），含對羥基苯甲酸與防腐劑疊氮化鈉（0.09% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限請查看單獨的試劑瓶標簽。
2 號瓶：（x2）
過氧化物酶，4-氨基安替比林和穩定劑；凍干粉。
置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看單獨的試劑瓶標簽。
3 號瓶：
D-葡萄糖（約 10 g）。
D-葡萄糖（約 10 g）。
室溫密封保存。有效期限請查看單獨的試劑瓶標簽。
4 號瓶：
葡萄糖氧化酶標準品（約 2.9 U；實際酶活力值請查看試劑瓶標簽）。
置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看單獨的試劑瓶標簽。
5 號瓶：
緩沖液（5 mL，pH 7.0），BSA（0.5 % w/v）和防腐劑疊氮化鈉（0.04% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限請查看單獨的試劑瓶標簽。
試劑溶液制備：
1. 用蒸餾水將其中一個 1 號瓶內容物稀釋至近 150 mL，得到溶液 1。現配現用。需要時再稀釋第二個 1 號瓶的內容物。
2. 將其中一個 2 號瓶的內容物溶解于溶液 1 中。檢查 pH 值，如有必要，用 1 M 鹽酸（HCl）或 1 M 氫氧化鈉（NaOH）調節 pH 至 7.0。定容至 200 mL，得到溶液 2（POD 混合溶液）。
在 4 ℃下可穩定 1 個月以上，在-10 °C 以下可穩定 12 個月以上。
如需冷凍保存，應將試劑分裝在聚丙烯容器中保存。不可反復凍融。
3. 稱取 4.5 g 3 號瓶內容物（D-葡萄糖），溶解于 40 mL 蒸餾水中。定容至 50 mL，得到溶液 3（D-葡萄糖）。
在-10 ℃以下可穩定 12 個月以上。
4.& 5. 用蒸餾水將 5 號瓶內容物稀釋至近 40 mL，得到溶液 4。用約 3 mL溶液 4 溶解 4 號瓶內容物。將溶液定量轉移至一個 50 mL 的容量瓶中。再用約 5 mL 溶液 4 沖洗 4 號瓶，將剩余內容物轉移至容量瓶中。將剩余溶液 4 倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 50 mL。將溶液分裝成10 mL 小份儲存在聚丙烯容器中，得到溶液 5（葡萄糖氧化酶標準溶液）。
在-10 °C 以下可穩定 2 年以上。
注意：
只有在懷疑檢測使用的分光光度計的準確性，或者懷疑樣品中的某些物質具有抑制作用時，才在手動檢測程序（A）中對葡萄糖氧化酶標準溶液（溶液 5）進行測定。檢測程序 B 或 C 必須使用溶液 5。
提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A）：
注意：
只有在懷疑檢測使用的分光光度計的準確性，或者懷疑樣品中的某些物質具有抑制作用時，才在手動檢測程序（A）中對葡萄糖氧化酶標準溶液（溶液 5）進行測定。檢測程序 B 或 C 必須使用溶液 5。
提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A）：
0.1 M 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），含 0.5 mg/mL BSA 和防腐劑 0.02%（w/v）疊氮化鈉。
向 800 mL 蒸餾水中加入 13.6 g 磷酸二氫鉀（MW=136.1），用 2 M 氫氧化鈉調節pH 至 7.0。定容至 1 L。加入 0.5 g BSA（Sigma 貨號 A2153）和 0.2 g 疊氮化鈉（Sigma 貨號 S2002）并溶解，得到緩沖液 A。
設備（推薦）：
設備（推薦）：
1. 容量瓶（50 mL 和 100 mL）。
2. 一次性塑料比色皿（光徑 1 cm，容量 3.0 mL）。
3. 微量移液器，例如 Gilson Pipetman®（1000 μL）。
4. 正位移移液器，例如 Eppendorf Multipette®，帶 25 mL Combitip®移液管[移取0.5 mL 溶液 3（D-葡萄糖）和 2.0 mL 溶液 2（POD 混合溶液）]。
5. 分析天平。
6. 記錄式分光光度計，波長設置為 510 nm，溫度設置為 25±0.1 °C。
7. 旋渦混合器（如 IKA® Yellowline 試管振蕩器 TTS2）。
樣品制備示例：
測定酶制劑中的葡萄糖氧化酶。準確稱取約 100 mg 葡萄糖氧化酶制劑置于一個100 mL 的燒杯中。加入 50.0 mL 提取/稀釋緩沖液（緩沖液 A），在磁力攪拌器上輕輕攪拌，直至完全溶解。取 1.00 mL 溶液轉移至一個 100 mL 的容量瓶中進行稀釋，用緩沖液 A 定容至刻度線。倒置混合均勻，并根據需要進行進一步稀釋，以獲得適合檢測的酶濃度（0.01-0.08 U/mL）。
A.手動檢測程序：
波長：510 nm
比色皿：1 cm 光徑（玻璃或塑料材質）
溫度：25 ± 0.1 °C
最終體積：3.0 mL
樣品溶液：葡萄糖氧化酶稀釋至 0.01-0.08 U/mL
以空氣（光路中不放置比色皿）或蒸餾水為空白
計算：
注意：可以使用 Mega-CalcTM來簡化這些計算。
測定空白和樣品的吸光度差值（A2-A1）。從樣品吸光度差值中減去空白吸光度差值，得到樣品的 20 分鐘∆A510 nm。盡管用葡萄糖氧化酶孵育后的吸光度增加值與孵育時間呈線性關系（圖 1，第 6 頁），葡萄糖氧化酶活力值（mU/檢測溶液，即/0.5 mL）與孵育 20 分鐘后在 510 nm 波長下測得的吸光度增加值的標準曲線并不具有完美的線性關系（圖 2，第 7 頁）。參照圖 2 中的標準曲線，得出酶活力值（mU/0.5 mL），計算方法如下：
U/L 樣品溶液 = mU/0.5 mL× 2000 ×1/1000× D
= mU/0.5 mL × 2 × D
式中：
參照標準曲線（圖 2，第 7 頁），得出 20 分鐘∆A510 nm 對應的 mU/0.5 mL。
2000 =1 L 至 0.5 mL 的轉換系數
1/1000 =mU 至 U 的轉換系數
D =稀釋倍數（即，如果將樣品稀釋 10 倍，則 D=10）
對于固體和半固體樣品，在樣品制備過程中稱量其質量，并按以下公式計算稱重樣品的酶活力（U/g）：
葡萄糖氧化酶活力（U/g 制劑）
= GOX 活力 [U/L 樣品溶液]/質量樣品[g/L 樣品溶液]
圖 1：檢測混合物中不同葡萄糖氧化酶濃度的反應曲線的線性關系。A. 0 mU；B. 10 mU；C. 20 mU；D. 30 mU；E. 40 mU。
mUnits/0.5 mL=（15.4 × Abs2）+（44.7 × Abs）+0.03
圖 2：葡萄糖氧化酶活力（mU/檢測溶液，即/0.5 mL）與 510 nm 波長下吸光度值的標準曲線。
B.自動分析儀檢測程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶自動分析儀檢測程序可使用單點標準法或完整校準曲線進行。
2. 對于用于葡萄糖氧化酶測定的每批樣品，必須使用同一批試劑進行單點校正
或繪制校準曲線。
試劑制備步驟如下：
制備 R1：
方法示例：
R1：0.250 mL
樣品：0.050 mL
反應時間：25 ℃下反應 20 分鐘
波長：510 nm
制備試劑的穩定性：冷藏可穩定 2 天以上
計算：動力學計算
反應方向：增加
線性度：0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶，樣品體積為 0.01 mL
C.微孔板檢測程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶微孔板檢測程序可使用單點標準法或完整校準曲線進行。
2. 對于用于葡萄糖氧化酶測定的每批樣品，必須使用同一批試劑進行單點校正或繪制校準曲線。
波長：510 nm
微孔板：96 孔（透明平底，玻璃或塑料材質）
溫度：25 °C
最終體積：0.300 mL
線性度：每孔 0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶（樣品體積為 0.05 mL）
計算（微孔板檢測程序）：
測定空白樣、樣品和校準曲線標準品（或單點法標準品）的吸光度差值（A2-A1）。從樣品和標準品吸光度差值中減去空白樣吸光度差值，得到 20 分鐘∆A510 nm。直接交叉參照 20 分鐘∆A510 nm 與葡萄糖氧化酶活力校準曲線，得到檢樣的葡萄糖氧化酶活力值。
或者：
如果在樣品制備過程中對樣品進行稀釋處理，則必須將結果乘以稀釋倍數，D。
標簽：
葡萄糖氧化酶K-GLOX
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