流體誘導(dǎo)分散分析FIDA在進(jìn)行溶液內(nèi)動(dòng)力學(xué)分析中的應(yīng)用

結(jié)合動(dòng)力學(xué)檢測(cè)是開發(fā)和表征蛋白類藥物的一個(gè)組成部分。目前結(jié)合動(dòng)力學(xué)的常用技術(shù)包括基于BLI和SPR的表面固定測(cè)量技術(shù)。表面固定測(cè)量技術(shù)具有諸多難點(diǎn)，比如表面化學(xué)成分需要優(yōu)化、非特異結(jié)合、需要純化樣本等。

在這里，我們提出了一種新的溶液內(nèi)測(cè)量方法（FIDA），僅使用納升到微升的樣品測(cè)量結(jié)合動(dòng)力學(xué)。該方法可以應(yīng)用于任何緩沖液條件或基質(zhì)環(huán)境中的蛋白相互作用。它易于設(shè)置，測(cè)量分析可全自動(dòng)化完成。

FIDA，(Flow Induced Dispersion Analysis) 即流體誘導(dǎo)分散分析，基于毛細(xì)管中層流運(yùn)動(dòng)的分析方法，當(dāng)樣品通過毛細(xì)管時(shí)，由于毛細(xì)管中心和毛細(xì)管壁之間速度不同，毛細(xì)管中心速度快，毛細(xì)管邊緣速度慢，樣品流動(dòng)呈拋物線剖面。不同的拋物線剖面（圖1.A）決定了信號(hào)曲線的形狀（圖1.B），結(jié)合斯托克愛因斯坦方程和泰勒分散公式，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)分子粒徑（size，流體力學(xué)半徑R_h）“第一性原理（first principle）”測(cè)量。FIDA的流體動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)量廣泛適用于生物分子穩(wěn)定性、構(gòu)象變化、相互作用等方面的研究。
 

 

圖1 FIDA基本原理。A. 樣品在毛細(xì)管中分散分布示意，橫截面輪廓形狀取決于帶有熒光的分子大小或其與配體形成的復(fù)合物大��；B. 信號(hào)峰：樣品流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生；C-D. 擴(kuò)散系數(shù)D和流體力學(xué)半徑R_h計(jì)算，擬合可得到分子互作親和力K_D值等。

除了結(jié)合動(dòng)力學(xué)（K_on和K_off）之外，F(xiàn)IDA還可測(cè)量平衡結(jié)合常數(shù)（K_D）和流體動(dòng)力學(xué)半徑（R_h）。使用FIDA方法獲得的數(shù)據(jù)與SPR非常吻合。
 

圖 2 親和體與利妥昔單抗相互作用示意圖；親和體作熒光標(biāo)記。

FIDA溶液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

圖3：FIDA溶液內(nèi)動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)流程

· 該指示劑(indicator)與微流控毛細(xì)管內(nèi)的分析物(analyte)混合。指示劑/分析物混合物在壓力驅(qū)動(dòng)下流過毛細(xì)管，當(dāng)通過探測(cè)器時(shí)記錄熒光信號(hào)。
· 檢測(cè)時(shí)間隨使用壓力（圖3a）改變。
· 指示劑的信號(hào)擬合曲線隨濃度、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和 K_D （圖3b） 而變化。
· Fidabio數(shù)據(jù)分析軟件模塊擬合數(shù)據(jù)以確定動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)（圖3c）。

FIDA和SPR蛋白-蛋白互作動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)比較

· K_D(FIDA) 測(cè)量使用FIDA儀器480nm熒光檢測(cè)模塊，采用pre-mix分析模式。
· K_on(FIDA)與K_off(FIDA)測(cè)量采用cap-mix模式。
· SPR數(shù)據(jù)采用BiacoreX100平臺(tái)測(cè)量。
· 各平臺(tái)測(cè)試，均使用PBS緩沖液。

FIDA溶液內(nèi)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)亮點(diǎn)
1. 溶液中檢測(cè)，nL-uL樣品，無需表面固定
2. 快速分析方法開發(fā)----即使復(fù)雜樣品基質(zhì)
3. 實(shí)時(shí)R_h（結(jié)合化學(xué)計(jì)量比）測(cè)量，熒光強(qiáng)度和每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)質(zhì)控參數(shù)
4. 動(dòng)力學(xué)：5-10s到數(shù)小時(shí)
5. 快速K_off測(cè)定----無需表面再生