新型癌基因染色體外環狀DNA及檢測技術詳解

自從2019年11月，國際學術期刊《Nature》和《Cell》相繼發表了關于染色體外環狀DNA(extrachromosomal circular DNA)的重要研究，提出了這種游離于染色體基因組之外的DNA分子攜帶癌基因并具有轉錄活性，可能是某些癌癥的一大幫兇，染色體外環狀DNA頓時成為科研界尤其是生物醫學界的關注焦點。今天我們就為大家詳盡介紹染色體外環狀DNA的功能及研究方法。

內容提綱：
一、什么是染色體外環狀DNA
二、染色體外環狀DNA在腫瘤中的功能作用
1.促進癌基因擴增
2.促進腫瘤異質性和耐藥性
3.促進癌細胞基因重組
4.作為潛在分子標志物
三、云序生物提供的環狀DNA研究服務
1.組織細胞環狀DNA測序
2.血清血漿環狀DNA測序
3.血清血漿環狀DNA甲基化測序
4.環狀DNAsanger測序
5.環狀DNA純化柱
  游離于染色體基因組之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被發現常常以環狀的形式存在，這種形式的DNA被稱為eccDNA (extrachromosomal circular DNA）。目前也習慣將巨大的環狀DNA(>1Mb)稱為ecDNA而將相對較小的環狀DNA稱為eccDNA。染色體外環狀DNA最早是1965年在電子顯微鏡下被觀察到，但由于技術手段的限制，對其研究難以深入，一直以來只是偶有報道，并且對它們的種類、分布以及功能沒有全面的研究。隨著技術的發展，Paul Mischel團隊在2014年發現染色體外環狀DNA攜帶致癌基因EGFRvIII并且影響腫瘤的耐藥性，2017年發現染色體外環狀DNA在腫瘤中普遍存在。而2019年Mischel團隊和Scacheri團隊相繼在《Nature》和《Cell》上發表文章展示染色體外環狀DNA上攜帶的致癌基因可以高度表達，《Nature Communication》也報道了染色體外環狀DNA驅動神經母細胞瘤致癌基因重塑，接連發表的重磅文章使染色體外環狀DNA頓時成為熱門話題和科研焦點。現有研究表明，染色體外環狀DNA廣泛存在于各種物種、組織中，具有環狀結構，可以滾環擴增，細胞有絲分裂時由于無著絲粒因而會不均勻地分配到子細胞中，這些特點我們在往期文章《2020國自然研究熱點—eccDNA的前世今生》中做過詳盡的總結。
  從目前發表的文獻歸納，染色體外環狀DNA在腫瘤中的作用可主要分為以下3個功能機制，以及1個潛在的應用方向：
1.促進癌基因擴增
2.促進腫瘤異質性和耐藥性
3.促進癌細胞基因重組
4.作為潛在分子標志物
下面我們一起來看看這4方面的研究結果。
  染色體外環狀DNA可以攜帶完整的基因，尤其是腫瘤中染色體外環狀DNA經常攜帶致癌基因，不受控制的表達這些基因，最終可能導致腫瘤的惡性增長。除了增加癌基因拷貝數，還有研究表明，染色體外環狀DNA中染色質高度開放，并且其上存在著增強子序列，這些特征使染色體外環狀DNA本身轉錄活性提高，進一步增加其上癌基因的表達。

文章1：染色體外環狀DNA促進染色質的開放和促癌基因的表達
發表期刊：Nature
影響因子：42.778
發表時間：2019.11.20
文章鏈接：Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression
本文研究了三種人類癌細胞系和來自于TCGA的臨床腫瘤樣品，超高分辨率共聚焦顯微鏡展示了染色體外環狀DNA游離于染色體外及它們的環狀結構，并將WGS測序數據與RNA-seq數據聯合，通過單核苷酸多態性分析，發現染色體外環狀DNA是癌基因中表達豐度最高的基因之一。研究發現在eccDNA上面染色質的結構是高度開放的，利于基因表達，同時染色體外環狀DNA的環狀結構導致原本相距很遠的DNA片段，會被連接到一起，從而能夠實現超遠距離的相互作用和基因調控。本研究為深入了解染色體外環狀DNA結構如何影響癌基因提供了線索，并將染色體外環狀DNA與癌基因組學和表觀遺傳學聯系起來。

文章2：環狀染色體外DNA對癌基因的擴增
發表期刊：Cell
影響因子：38.637
發表時間：2019.12.12
文章鏈接：Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications
本研究發現，致癌基因EGFR基因經常會從染色體脫落而產生染色體外環狀DNA，并且EGFR和其在染色體外環狀DNA上序列上游非編碼區的增強子在膠質母細胞瘤中共同擴增。對多種癌種的樣本進行同樣分析發現不同實體腫瘤類型中均存在類似的癌基因與增強子顯著共擴增的現象。進一步研究證明腫瘤細胞中的癌基因通過高級擴增與環化而形成的對自身調控活性的增強，是一個十分有效的促癌機制。本文揭示了染色體外環狀DNA特殊的染色質結構及其功能，為后續的基礎與應用研究，奠定了重要的基礎。

文章3：ecDNA與致癌基因擴增及多種癌癥不良預后相關
發表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發表時間：2020.08.17
文章鏈接：Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers
染色體外DNA (ecDNA)擴增促進腫瘤內遺傳異質性并加速腫瘤進化；然而，其頻率和臨床影響尚不清楚。通過對3212名癌癥患者全基因組測序數據的計算分析，本文發現ecDNA擴增經常發生在大多數癌癥類型中，但不發生在血液或正常組織中。癌基因在擴增的細胞外基質上高度富集，最常見的復發性癌基因擴增發生在細胞外基質上。與拷貝數匹配的線性DNA相比，ecDNA擴增導致更高水平的癌基因轉錄，同時染色質可及性增強，更經常地導致轉錄物融合。即使在控制組織類型的情況下，癌癥攜帶內皮祖細胞基因的患者的生存期也明顯短于癌癥不受基于內皮祖細胞基因的癌基因擴增驅動的患者。本文的結果表明，基于ecDNA的癌基因擴增在癌癥中很常見，不同于染色體擴增，導致許多癌癥類型的患者預后不良。

文章4：調控癌基因轉錄
發表期刊：Cancer Cell
影響因子：26.602
發表時間：2021.4.8
文章鏈接：Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription
本文發現，培養的膠質母細胞瘤患者來源的神經球和前列腺癌細胞中，ecDNAs具有廣泛的ecDNA-ecDNA間和ecDNA-染色體間互作。ecDNA-染色體互作位點具有廣泛、高水平的H3K27ac信號，主要集中在表達水平增加的染色體基因上。在前列腺癌細胞中加入含有特征增強子的合成ecDNA，導致染色體基因轉錄的全基因組激活。對ecDNAs的染色體靶點進行單分子分辨率的解析，發現活躍性表達的癌基因在空間上聚集在ecDNA介導的互作網絡中。研究表明ecDNAs可以作為移動的轉錄增強子來促進腫瘤的進展，并顯示了一種潛在的合成非整倍體的轉錄調控機制。
  染色體外環狀DNA由于不帶著絲粒元件，因此不能通過有絲分裂的方式均勻分配到分裂后的細胞中，而是通過不對稱分布，促進腫瘤內細胞的異質性。而且如果攜帶癌基因的拷貝數對腫瘤細胞的耐藥性及對環境適應能力有影響，那么這種異質性會提高腫瘤內產生能夠適應環境的細胞的幾率，從而加速腫瘤的進化。

文章1：ecDNA促進腫瘤細胞進化和基因異質性
發表期刊：Nature
影響因子：42.778
發表時間：2017.3.2
文章鏈接：Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity
本文由加州大學圣地亞哥分校的Paul Mischel教授領導的研究團隊完成，共分析了17種不同的癌細胞的ecDNA。研究發現人類近一半腫瘤存在ecDNA，ecDNA是腫瘤的關鍵特征，它可以編碼多種促進腫瘤發生發展的基因。此外，他們還發現ecDNA上帶有的原癌基因可以使腫瘤細胞對環境具有更強的適應性，位于ecDNA上或染色體內部的原癌基因拷貝機制有很大差異，以至于導致原癌基因拷貝數差異和腫瘤異質性差異。這些特性使ecDNA在腫瘤細胞發生、產生多樣性及耐藥性過程中發揮的作用遠遠大于位于染色體中的相同基因發揮的作用，即ecDNA能夠驅動腫瘤的異質性和耐藥性。 

文章2：促進膠質母細胞瘤中耐藥性作用
發表期刊：Science
影響因子：41.845
發表時間：2014.1.3
文章鏈接：Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA
本文在基因層面分析了膠質母細胞瘤的耐藥機制，發現ecDNA通過使腫瘤迅速改變其所含癌基因的數量，在某些腦癌耐藥性中發揮著核心作用，而且還能決定一個細胞是否會轉變為癌細胞。EGFR TKI處理后ecDNA上的EGFR基因被去除，停藥后，ecDNA上的克隆EGFR突變會再次出現，通過該途徑，癌細胞可以逃避針對維持在ecDNA上的癌基因的靶向治療。本研究揭示了ecDNA可能通過一種高度特異性、動態性和適應性的途徑幫助癌細胞逃避針對ecDNA上癌基因的藥物治療，暗示了與持續給藥相比，高劑量脈沖間歇治療可能會有更好的靶向抑制作用，同時使腫瘤恢復藥物敏感性。

文章3：促進神經母細胞瘤的進化
發表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發表時間：2018.5
文章鏈接：Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma
為了了解膠質母細胞瘤（GBM）的基因組異質性是如何導致治療反應不良的，本研究對GBM樣本、神經球和原位異種移植模型進行了DNA和RNA測序。數據分析顯示，ecDNA上單核苷酸變異、局部DNA改變和癌基因擴增是從腫瘤樣品傳播到模型系統上的主要體細胞驅動變異。作者推斷，后代細胞對ecDNA的遺傳是不均勻的，而這一特征會影響后代細胞的致癌潛能。分析發現，帶有癌基因的ecDNA在整個疾病過程中經常被保留。這些結果表明，染色體外的元素能使GBM進化過程中基因組異質性迅速增加，而與染色體DNA改變無關。
  早期的研究認為染色體外環狀DNA形成是由短重復序列介導的，主要通過基因重組機制實現，而反方向上，研究揭示了染色體外環狀DNA也可重新整合到線性基因組，導致致癌基因重組。這些重組過程中，不僅可能發生癌基因拷貝數擴增，而且可能使原本相距較遠的轉錄調控元件重排在鄰近區域，改變基因的表達，影響腫瘤的形成和發展。

文章1：驅動神經母細胞瘤致癌基因組重塑
發表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發表時間：2019.12.16
文章鏈接：Extrachromosomal circular DNA drives oncogenic genome remodeling in neuroblastoma
本文章檢測神經母細胞瘤中eccDNA，繪制了表達譜，不僅發現了多種未被發現過的eccDNA，還發現eccDNA是體細胞基因組重排的主要來源。研究揭示了eccDNA通過嵌合環化和重新整合到線性基因組中的方式，導致致癌基因重組。這種環狀上產生的基因重組具有重要功能和臨床意義，如果這些發現能擴展到其他癌癥并更深入地進行一些分析，將為理解癌癥基因重塑提供新的方向。
  染色體外環狀DNA與腫瘤有如此密切的關系，有文獻提出了染色體外環狀DNA可能具有作為腫瘤分子標志物的潛力。NIPT之父盧煜明教授的新研究表明：除了表達水平，環狀DNA分子的甲基化狀況也可作為一類新的分子標志物。

文章1：母體血漿中eccDNA的鑒定
發表期刊：PNAS
影響因子：9.412
發表時間：2020.1.3
文章鏈接：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma
文章檢測了懷孕母體血漿中的eccDNA，發現這些eccDNA分子長度呈雙峰分布，eccDNA整體長度要大于線性DNA，且母體來源的eccDNA長度大于胎兒來源的eccDNA。文中提出，eccDNA的環狀結構可能使他們更加耐受限制性外切酶，因此比線性DNA更加穩定。這一特性使eccDNA存在作為分子標志物的潛力。

文章2：母體血漿中eccDNA甲基化的鑒定
發表期刊：Clinical Chemistry
影響因子：7.292
發表日期：2021.2
文章鏈接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
首次揭示了eccDNA的甲基化狀態。研究比較了母體和胎兒來源的血漿eccDNA的甲基化密度，以及小分子和大分子之間的甲基化密度，并研究了胎兒eccDNA在母體循環中的清除情況。

我們可以看到eccDNA對腫瘤的發生發展在如此多方面具有潛在影響，無論是作為癌基因表達調控因子，還是新型的特異性腫瘤標志物，eccDNA都具有極高的研究價值，近年來已成為生物醫學界火熱的明星分子。那么想要揭示eccDNA的種類、表達以及功能該從何入手呢？

云序生物2019年全國首fa組織細胞環狀DNA測序服務，基于circle-seq方法，通過柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效純化富集環狀DNA，具有檢出率高、準確性好等優點。2020年云序生物又首fa推出血清血漿環狀DNA測序服務，參考盧煜明教授團隊開發的方法，充分利用Tn5轉座酶高效低損地片段化環狀DNA，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。今年，云序生物再次全國首fa環狀DNA甲基化測序服務，用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，可同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化狀況。另外針對測序結果篩選出的環狀DNA，云序生物還提供sanger測序驗證服務。
1.組織細胞環狀DNA測序
2.血清血漿環狀DNA測序
3.血清血漿環狀DNA甲基化測序
4.環狀DNA sanger測序
5.環狀DNA純化柱

1.組織細胞環狀DNA測序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。

參考文獻：
Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue

實驗流程：
1)柱純化
相對于大量存在的基因組DNA，環狀DNA在細胞中的含量非常少，因此從樣品中提取總DNA后，第一步需要通過柱純化去除基因組DNA，以免測序中基因組DNA占據大部分數據量。柱純化這一步驟十分關鍵，既要最大限度地去除基因組DNA, 又需最大限度保留環狀DNA分子，尤其是避免丟失掉超長和超短的環狀DNA。云序生物采用A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分eccDNA高分文章中所使用的純化柱，并且云序生物是該品牌在國內的唯yi總代理。
在最終測序結果證實檢測到的環狀DNA短至100多bp，長至9M。
2)酶消化
經過了柱純化，依然會有少量的線性DNA殘留，因此第二步利用環狀DNA耐受限制性外切酶的特點，用外切酶對柱純化后產物進行酶消化。對人類樣品，會特別的先使用針對人類線粒體的限制性內切酶MssI將環狀的線粒體DNA剪切成線性DNA,再進行外切酶消化，一并去除線粒體DNA。
3)滾環擴增
經過前兩步酶消化和純化，基因組線性DNA被去除，保留下來的環狀DNA因為總量較少，所以需要通過滾環擴增放大環狀DNA信號，使之達到建庫所需的DNA量。
4)建庫測序
對純化和擴增富集的后的環狀DNA，進行常規的NGS高通量測序。流程包括片段化，建庫和使用Illunina NovaSeq測序儀進行150bp雙端測序。
技術優勢：

• 使用原裝A&A biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
• 滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率
• 專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表

2.血清血漿環狀DNA測序
針對血清血漿微量樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。

參考文獻：
Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma

實驗流程：
1)環狀DNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達到富集環狀DNA的目的。
2)加接頭：通過轉座酶打開環狀DNA的環形結構，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3)末端修復：通過Klenow酶修復轉座產物的末端缺口。
4)建庫測序：純化后文庫質檢合格后進行上機測序。

技術優勢：

• 減少DNA損失
• 保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確

3.血清血漿環狀DNA甲基化測序
針對血清血漿樣品，云序參考盧煜明教授團隊今年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。

參考文獻：
Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance

實驗流程：
1)環狀DNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達到富集環狀DNA的目的。
2)加接頭：通過轉座酶打開環狀DNA的環形結構，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3)末端修復：通過Klenow酶修復轉座產物的末端缺口。
4)C-U轉化：通過溫和的酶轉化法，將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉化為尿嘧啶（U）。
5)PCR擴增：對轉化后產物進行PCR擴增及純化。
6)上機測序：純化后文庫質檢合格后進行上機測序。

技術優勢：

• 一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
• 單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析

4.環狀DNA sanger測序
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。

原理：
針對環狀DNA的break point設計反向引物

結果展示：

5.環狀DNA純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的唯yi總代理。