人前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒使用說明書

產(chǎn)品編號：EH4233
尺寸：48T/96T
特異性：人
范圍：31.2-2000pg/ml
靈敏度：<18.75pg/ml
應(yīng)用：用于定量檢測血清，血漿，組織勻漿和其他生物體液中的PGE2。
儲存：4℃，6個月
注意：僅供研究使用。
 
套件組件

Item	Specifications(48T/96T)	Storage
MicroELISAPlate(Dismountable)	8×6or8×12	4℃/-20℃
LyophilizedStandard	1vialor2vial	4℃/-20℃
Sample/Standarddilutionbuffer	10ml/20ml	4℃
Biotin-detectionantibody(Concentrated)	30ul/60ul	4℃
Antibodydilutionbuffer	5ml/10ml	4℃
HRP-StreptavidinConjugate(SABC)	60ul/120ul	4℃(shadinglight)
SABCdilutionbuffer	5ml/10ml	4℃
TMBsubstrate	5ml/10ml	4℃(shadinglight)
Stopsolution	5ml/10ml	4℃
Washbuffer(25X)	15ml/30ml	4℃
PlateSealer	3/5pieces
ProductDescription	1copy

 
分析原理
該ELISA試劑盒使用競爭性ELISA作為方法。該試劑盒中提供的微量滴定板已經(jīng)預(yù)先涂有PGE2。在反應(yīng)過程中，PGE2在樣品或標準品中在固相支持物上與固定量的PGE2競爭生物素化檢測PGE2特異性抗體。過量的共軛和未結(jié)合的樣品或從平板中洗去標準品，并向每個微孔板中加入HRP-鏈霉抗生物素蛋白（SABC）好好孵化。然后將TMB底物溶液加入每個孔中。酶底物加入硫酸溶液終止反應(yīng)，顏色變化用分光光度法在450nm波長下測量。PGE2的濃度然后通過比較樣品的OD與標準曲線確定樣品。
 
注意事項
1.為了檢驗實驗操作的有效性和樣品稀釋比例的適當性，建議使用標準品和少量樣品進行試驗性試驗。
2.打開后和使用前，保持板干。
3.在使用套件之前，旋轉(zhuǎn)管并將所有組件放下管的底部。
4.儲存TMB試劑避光。
5.洗滌過程非常重要，不能充分洗滌容易造成誤報。
6.對于標準和樣品測試，建議使用重復(fù)孔測定。
7.在測定時不要讓Micro板干燥，因為干板會使板上的活性組分失活。
8.不要重復(fù)使用吸頭和管子以避免交叉污染。
9.避免將不同批次的試劑一起使用。
 
所需材料但未提供
1.酶標儀（波長：450nm）
2.37℃培養(yǎng)箱
3.自動洗板機
4.精密單通道和多通道移液槍和一次性槍頭
5.清潔管和Eppendorf管
6.去離子水或蒸餾水
 
手動清洗
丟棄板中的溶液而不接觸側(cè)壁。將板拍在吸收性濾紙或其他吸收性材料上。用350ul洗滌緩沖液完全填充每個孔并浸泡1至2分鐘，然后從板上吸出內(nèi)容物，并將板拍在吸收性濾紙或其他吸收性材料上。重復(fù)此過程兩次，共洗滌三次。
自動清洗
吸出所有孔，然后用350ul洗滌緩沖液洗滌板三次。最后一次清洗后，倒轉(zhuǎn)板，并將板拍在吸收性濾紙或其他吸收性材料上。建議將墊圈設(shè)置為浸泡1分鐘。
樣品采集和存儲
收集后立即分離測試樣品，然后立即分析（2小時內(nèi)）。或等分并在-20℃下長期保存。避免多次凍融循環(huán)。
血清：將全血樣品置于室溫下2小時或?qū)⑵渲糜?℃過夜，以約1000×g離心20分鐘，收集上清液并立即進行測定。血液采集管應(yīng)該是一次性的，無熱原的和非內(nèi)毒素。
血漿：使用EDTA-Na2作為抗凝血劑收集血漿。在收集后30分鐘內(nèi)，在2-8℃下以1000×g離心樣品15分鐘。收集上清液并立即進行測定。避免溶血，高膽固醇樣本。
組織勻漿：由于溶血血液與檢測結(jié)果有關(guān)，因此必須通過用預(yù)先冷卻的PBS緩沖液（0.01M，pH=7.4）清洗組織來去除殘留的血液。稱重后將組織剁碎并在PBS中均質(zhì)化（體積取決于組織的重量。一般來說，9mLPBS適用于1克組織塊。一些蛋白酶抑制劑建議添加到PBS中）用玻璃在冰上均化器。為了進一步破壞細胞，您可以使用超聲波細胞破碎器對懸浮液進行超聲處理，或?qū)⑵渲糜趦鋈谘�環(huán)中。然后將勻漿以5000×g離心5分鐘以得到上清液。
細胞培養(yǎng)上清液：在2-8℃下以1000×g離心上清液20分鐘，除去不溶性雜質(zhì)和細胞碎片。收集清澈的上清液并立即進行檢測。
其他生物流體：在2-8℃下以1000×g離心20分鐘。收集上清液并立即進行測定。
樣品制備：樣品應(yīng)清澈透明，離心除去懸浮固體。
 
注意：5天內(nèi)使用的樣品可以在4℃下儲存，此外，樣品必須儲存在-20℃（分析≤1個月）或-80℃（分析≤2個月），以避免失去生物活性和污染。溶血樣品不適用于該測定。
 
樣品稀釋指南
最終用戶應(yīng)估計測試樣品中目標蛋白的濃度，并選擇合適的稀釋因子，使稀釋的目標蛋白濃度落在試劑盒的最佳檢測范圍內(nèi)。用提供的稀釋緩沖液稀釋樣品，可能需要進行多次試驗。必須將測試樣品與稀釋緩沖液充分混合。并且還應(yīng)在預(yù)試驗中制作標準曲線和樣品。以下稀釋溶液僅供參考：
高濃度（20000-200000pg/ml）：稀釋：1：100（即將1μl樣品加入99μl樣品/標準稀釋緩沖液中。）
中濃度（2000-20000pg/ml）：稀釋：1：10（即將10μl樣品加入90μl樣品/標準稀釋緩沖液中。）
低濃度（31.2-2000pg/ml）：稀釋：1：2（即將50μl樣品加入50μl樣品/標準稀釋緩沖液中。）
濃度極低（≤31.2pg/ml）：無需稀釋或以1：2稀釋。
 
試劑制備和儲存
使用前將試劑盒置于室溫下20分鐘
1、洗滌緩沖液：
用去離子水或蒸餾水將50mL濃縮洗滌緩沖液稀釋到750mL洗滌緩沖液中。將未使用的溶液放回4℃。如果在濃縮液中形成晶體，可以用40℃水浴加熱（加熱溫度不應(yīng)超過50℃）并輕輕混合直至晶體完全溶解。使用前應(yīng)將溶液冷卻至室溫。
2、標準：
1）.100ug/ml標準溶液：將1ml樣品/標準稀釋緩沖液加入一個標準管中，將管保持在室溫下10分鐘并徹底混合。
2）.50ug/ml→1.563ug/ml標準溶液：標記6個Eppendorf管，分別為1000pg/ml，分別為500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。在每個試管中加入0.3ml樣品/標準稀釋緩沖液。將0.3ml上述100ug/ml標準溶液加入第一管中并充分混合。將0.3毫升從第一管轉(zhuǎn)移至第二管并徹底混合。將0.3毫升從第2管轉(zhuǎn)移至第3管并徹底混合，依此類推。

注意：最好在2小時內(nèi)使用標準解決方案。標準溶液應(yīng)在4℃至12小時�；蛘邔⑵鋬Υ嬖�-20℃至48小時。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
3、生物素標記的抗體工作溶液的制備
在實驗前1小時內(nèi)準備好。
1）.計算工作溶液所需的總體積：0.05ml/孔×孔的數(shù)量。
（比總體積多0.1-0.2毫升）
2）.用抗體稀釋緩沖液以1：100稀釋生物素檢測抗體并徹底混合。
（即將1μl生物素標記的抗體加入99μl抗體稀釋緩沖液中。）
4、HRP-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合物（SABC）工作溶液的制備：
在實驗前30分鐘內(nèi)準備好。
1）.計算工作溶液所需的總體積：0.1ml/孔×孔的數(shù)量。
（比總體積多0.1-0.2毫升）
2）.用1：100的SABC稀釋緩沖液稀釋SABC并徹底混合。
（即將1μlSABC加入99μlSABC稀釋緩沖液中。）
 
分析程序
在將試劑加入孔中之前，在37℃下平衡TMB底物30分鐘。稀釋樣品和試劑時，必須將它們完全均勻混合。建議為每個測試繪制標準曲線。
1.分別在預(yù)涂板上設(shè)置標準，測試樣品和對照（零）孔，然后記錄它們的位置。建議一式兩份測量每個標準品和樣品。在添加標準，樣品和對照（零）孔之前洗滌板2次！
2.添加樣品和生物素檢測抗體：每次加入50μL標準品，空白樣品或樣品好。在空白孔中加入樣品/標準稀釋緩沖液。馬上加50μL生物素檢測抗體工作溶液到每個孔。用Plate密封劑蓋住我們提供。輕輕敲打板以確保充分混合。孵育45分鐘37℃。（溶液加到微量ELISA板的底部，避免內(nèi)壁盡最大努力撫摸和發(fā)泡。）
3.清洗：吸出每個孔并洗滌，重復(fù)該過程三次通過每次填充進行清洗以及使用噴射瓶，多通道移液器的洗滌緩沖液（約350μL），歧管分配器或自動洗衣機。在每一步完全去除液體是良好的表現(xiàn)至關(guān)重要。最后一次洗滌后，取出剩余的洗滌緩沖液吸氣或傾倒。翻轉(zhuǎn)平板并將其輕輕擦拭干凈的吸水紙。
4.HRP-鏈霉抗生物素蛋白綴合物（SABC）：向每個孔中加入100μLSABC工作溶液。蓋上新的Plate封口機。在37℃孵育30分鐘。
5.洗滌：重復(fù)抽吸/洗滌過程五次。
6.TMB底物：TMB底物添加90μL，每孔。蓋上一塊新板密封劑。在37℃下孵育約15-20分鐘。避光。反應(yīng)時間可以根據(jù)實際顏色變化縮短或延長，但不得超過30分鐘。當標準孔中出現(xiàn)明顯的梯度時，可以終止反應(yīng)。
7.停止：每孔加入50μL終止液。顏色立即變?yōu)辄S色。添加停止溶液的順序應(yīng)與基質(zhì)溶液相同。
8.OD測量：使用a確定每個孔的光密度（OD值）酶標儀設(shè)定為450nm。您應(yīng)該提前打開酶標儀，預(yù)熱儀器，并設(shè)置測試參數(shù)。
 
計算結(jié)果
平均每個標準品和樣品的重復(fù)讀數(shù)。通過創(chuàng)建標準曲線繪制y軸或x軸上每個標準品的平均OD值與濃度的關(guān)系在x軸或y軸上，通過圖表上的點繪制最佳擬合曲線。它是建議使用一些專業(yè)軟件來做這個計算，比如曲線專家1.3或1.4。在軟件界面中，將計算標準曲線的最佳擬合方程使用OD值和標準樣品的濃度。該軟件將計算進入OD樣品后的樣品濃度。此外，您可以輸入相應(yīng)的擬合方程和OD值將樣品加入Excel中得到濃度樣本。如果樣品已稀釋，則從標準曲線計算濃度必須乘以稀釋因子。如果樣品的OD超過上限標準曲線，應(yīng)在適當稀釋后重新測試。實際濃度是計算濃度乘以稀釋倍數(shù)。建議使用專業(yè)軟件曲線專家為1.3，詳情請訪問：http：//www.fn-test.com/services/software-download/。
注意：如果測量的樣品被稀釋，則將稀釋因子乘以插值的濃度，以獲得稀釋前的濃度。
 
摘要
1.在添加標準，樣品和對照（零）孔之前洗滌板2次！
2.每孔加入50μL標準品或樣品。
3.立即向每個孔中加入50μL生物素檢測抗體。
4.在37℃孵育45分鐘。
5.吸取并洗滌板3次。
6.每孔加入100μL SABC工作溶液。在37℃孵育30分鐘。
7.吸取并洗滌板5次。
8.加入90μLTMB底物。在37℃孵育15-20分鐘。
9.加入50μL終止液。立即讀取450nm。
10.結(jié)果的計算
 
典型數(shù)據(jù)和標準曲線
PGE2 ELISA試劑盒的典型標準操作的結(jié)果如下所列。該標準曲線在我們的實驗室中生成，僅用于演示目的。用戶應(yīng)按自己的實驗獲得標準曲線。（N/A=不適用）

X	pg/ml	0	31.25	62.5	125	250	500	1000	2000
Y	OD450	1.887	1.111	0.617	0.35	0.217	0.146	0.106	0.067

 
特異性
該測定法對PGE2的檢測具有高靈敏度和優(yōu)異的特異性。沒有觀察到PGE2和類似物之間的顯著交叉反應(yīng)性或干擾。
注意：受現(xiàn)有技術(shù)和知識的限制，我們很難完成PGE2與所有類似物之間的交叉反應(yīng)檢測，因此，交叉反應(yīng)可能仍然存在。
 
復(fù)蘇
下面列出的基質(zhì)加入一定水平的PGE2，并通過將測量值與樣品中預(yù)期的PGE2量進行比較來計算回收率。
 

Matrix	Recovery range (%)	Average(%)
serum(n=5)	89-103	95
EDTA plasma(n=5)	85-97	91
heparin plasma(n=5)	86-104	93

 
線性
通過測試摻入適當濃度的PGE2及其連續(xù)稀釋的樣品來測定試劑盒的線性。結(jié)果通過計算濃度與預(yù)期的百分比來證明。
 

Sample	1:2	1:4	1:8	1:16
serum(n=5)	85-102%	91-102%	89-101%	86-104%
EDTA plasma(n=5)	85-99%	94-100%	82-98%	84-101%
heparin plasma(n=5)	83-100%	81-97%	90-98%	91-93%

 
精密度
測定內(nèi)精密度（測定內(nèi)的精確度）：分別在一個平板上測試3個具有低，中和高水平Ig的樣品20次。
批間精密度（測定之間的精確度）：在3個不同的平板上測試3個具有低，中和高水平Ig的樣品，每個平板8個重復(fù)。
CV（％）= SD/meanX100
批次內(nèi)：CV<8％
批次間：CV<10％
 
穩(wěn)定性
ELISA試劑盒的穩(wěn)定性由活性損失率決定。在適當?shù)膬Υ鏃l件下，該套件的失效率在失效日期內(nèi)低于10％。

Standard (n=5)	37°C for 1 month	4°C for 6 months
Average(%)	80	95-100

 
溫馨提醒：為了盡量減少對性能，操作程序和實驗室條件的額外影響，特別是室溫，空氣濕度，培養(yǎng)箱溫度應(yīng)嚴格控制。還強烈建議整個測定由相同的操作者進行從頭到尾。
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