一項結合速度優化的DNA鏡像序列成像新策略實現高效12重超分辨成像
在生命科學領域，理解細胞分子結構的納米級細節對揭示宏觀生物功能至關重要。然而，傳統成像技術如免疫熒光或質譜成像的空間分辨率受限，難以捕捉蛋白質相互作用的分子尺度信息。盡管超分辨顯微鏡技術如STORM或DNA-PAINT已實現納米級分辨率，但其多靶標成像能力受限于熒光標記通道數目和成像速度。本文介紹了一項結合速度優化的右旋DNA與左旋DNA（鏡像序列）的成像新策略，實現了高效12重超分辨成像。該方法通過簡化標記流程，在單蛋白分辨率下對復雜神經元互作網絡進行三維測繪，僅需10小時即可完成200×200微米的大視野成像，將傳統需數周的實驗壓縮至一天內完成。
本研究成果由Eduard M. Unterauer、Eva-Maria Schentarra、Isabelle Pachmayr、Taisha Tashrin等共同主導，題為《Left-handed DNA for efficient highly multiplexed imaging at single-protein resolution》，于2025年10月《Nature Communications》正式發表。
重要發現
01左旋DNA-PAINT技術原理與序列優化
研究團隊基于右旋DNA-PAINT的速度優化序列（R1-R6），設計并合成了其鏡像版本——左旋DNA序列（L1-L6）。這兩種序列在結構和化學性質上互為鏡像，但具有相同的雜交特異性。通過將6條右旋和6條左旋序列組合，構建出12通道正交探針庫，可直接用于Exchange-PAINT工作流程，無需引入次級標記或鏈置換反應。這種設計顯著降低了實驗復雜度，避免了對瞬態DNA條形碼的依賴，使非專業用戶也能輕松實現高性能多重成像。
在DNA折紙納米結構上進行的驗證實驗中，左旋序列展現出與右旋序列相當的空間分辨率（亞5納米）和結合動力學特性。研究人員成功對間距僅15納米的單個結合位點進行清晰分辨，且序列間無交叉干擾。特別是在5納米間距的DNA折紙測試中，L1序列實現約1.4納米的定位精度，證實其分子級分辨能力。
在細胞環境中，團隊選取核孔蛋白Nup96、線粒體外膜蛋白Tom20和微管蛋白α-Tubulin作為超分辨成像基準標志物。通過3D成像，不僅分辨出核孔復合體中相距約13納米的單個Nup96蛋白，還清晰呈現了線粒體膜上Tom20的分布以及直徑約30納米的微管纖維結構。
03結合動力學表征通過DNA折紙和細胞核孔復合體實驗，系統比較了12條序列的“亮態”與“暗態”時間分布。盡管右旋序列R2與左旋序列L2在亮態時間上存在差異，但所有序列的整體動力學參數與既往報道的速度優化序列相符，表明左旋DNA-PAINT在保持高速成像的同時不影響探針的結合特異性。
0413重神經元圖譜測繪應用
研究團隊將這一技術應用于原代海馬神經元，繪制了13種蛋白質（12重Exchange-PAINT加Lifeact標記的肌動蛋白）的三維相互作用圖譜。在200×200微米視野內，以約12納米的空間分辨率（定位精度約5納米）完整捕獲了神經元細胞骨架、細胞器及突觸蛋白的納米級分布。實驗僅耗時約10小時，相較傳統Exchange-PAINT技術（需約一個月）效率提升近百倍。
該圖譜首次在單蛋白分辨率下揭示了興奮性突觸（Bassoon、PSD95、VGlut1）與抑制性突觸（Bassoon、Gephyrin、VGAT）的分子組成，并發現了一種新型混合突觸（Gephyrin與VGlut1共定位）。此外，研究還觀察到過氧化物酶體（Pmp70）與高爾基體（Golga5）間的潛在膜接觸位點，為細胞器間通訊研究提供了新線索。通過三維渲染，清晰展示了βII-血影蛋白的環狀結構、神經纖維絲的分布以及線粒體在軸突和樹突中的形態多樣性。
創新與亮點
01突破多重成像的速度瓶頸
本研究最大創新點在于將左旋DNA序列引入速度優化DNA-PAINT框架，解決了高階多重超分辨成像中速度與復雜度難以兼顧的難題。傳統多重成像需依賴有限的光譜通道或耗時的探針交換流程，而左-右旋DNA組合將可用序列空間擴展一倍，在不增加光學硬件負擔的前提下實現12重并行檢測。其成像速度較常規Exchange-PAINT提升兩個數量級，使大視野納米級空間蛋白質組學分析進入“小時級”時代。
由于左旋DNA不易被細胞內核酸酶降解，且與右旋DNA無交叉反應，該技術顯著降低了非特異性背景信號。實驗流程無需復雜二級標記，僅通過一輪抗體孵育和多輪左/右旋成像鏈孵育即可完成，極大提升了方法的魯棒性和可重復性。這種“即插即用”式設計打破了超分辨技術對專業操作人員的依賴，有望推動其在臨床診斷中的應用。
03為生物醫學研究提供新范式
該技術首次在單神經元尺度同時解析網絡連接與分子組成，為研究神經退行性疾病、突觸可塑性提供了全新工具。例如，通過對比健康與病變神經元中多種蛋白質的納米級分布差異，可揭示阿爾茨海默癥等疾病早期的結構改變。此外，方法兼容性高，只要具備相應的一級親和試劑，即可推廣至腫瘤微環境、免疫細胞相互作用等研究場景，實現“跨尺度”生物醫學成像。
總結與展望
左旋DNA-PAINT技術通過巧妙利用鏡像核酸化學，成功打破了超分辨多重成像在通量、速度與易用性之間的平衡瓶頸。其能夠在單蛋白分辨率下，以小時級耗時完成復雜
細胞系統的多靶標測繪，為空間蛋白質組學研究樹立了新標桿。未來，該技術可與肽段-PAINT、擴增標記等策略進一步結合，將 multiplexing 能力提升至數十甚至上百種靶標。隨著更多針對疾病標志物的親和試劑的開發，這一方法有望在精準醫療領域發揮重要作用，例如用于病理切片中稀有生物標志物的定量分析或藥物靶點分布的納米級評估。盡管技術在標記效率、三維成像深度方面仍有優化空間，但其無疑為生命科學研究者提供了一把解鎖細胞納米世界的鑰匙。
聲明：本文僅用作學術目的。
Jevdokimenko K, Kowalewski R, Opazo F, Fornasiero EF, Masullo LA, Jungmann R. Left-handed DNA for efficient highly multiplexed imaging at single-protein resolution. Nat Commun. 2025 Oct 2;16(1):8773.
DOI:10.1038/s41467-025-64228-x.
