DNA-PAINT的超分辨率顯微技術(shù)原理和應(yīng)用介紹
By Alexander Auer & Ralf Jungmann
超分辨率1 技術(shù)使研究人員能夠以前所未有的精度在光的經(jīng)典衍射極限以下進(jìn)行成像。在實(shí)施單分子定位的過(guò)程中，分子在非熒光暗狀態(tài)（或關(guān)閉狀態(tài)）和熒光亮狀態(tài)（或開(kāi)啟狀態(tài)）之間“切換”，以便以亞衍射的精度選定和檢測(cè)它們的位置。通過(guò)獲取不僅單張而是一整疊圖像來(lái)構(gòu)建超分辨率圖像，其中在“開(kāi)啟狀態(tài)”中只記錄熒光分子的隨機(jī)子集（每幀都各不相同）。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬態(tài) DNA-DNA 相互作用。與 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他隨機(jī)方法相比，DNA-PAINT 技術(shù)中的熒光分子不會(huì)在暗態(tài)和亮態(tài)之間切換，所謂的“閃爍”是由短熒光 DNA 鏈與目標(biāo)的瞬時(shí)雜交（結(jié)合和解除結(jié)合）產(chǎn)生的（圖 1a）。一旦成像鏈結(jié)合到對(duì)接位點(diǎn)，熒光團(tuán)就會(huì)被固定，并且可以被相機(jī)檢測(cè)到。因?yàn)槌上矜準(zhǔn)莿?dòng)態(tài)補(bǔ)充的，所以 DNA-PAINT 不會(huì)受到光漂白的影響，這允許在與對(duì)接位點(diǎn)結(jié)合時(shí)提取固定成像鏈的全部光子容量，從而促成低至幾納米的卓越分辨率6。高信號(hào)背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)共聚焦顯微鏡7）相結(jié)合成為可能。我們用合成的 DNA 納米結(jié)構(gòu)測(cè)試了一款新的非制冷型科學(xué) CMOS 相機(jī) (pco.panda 4.2 bi)。因此，我們裝飾了一個(gè)扁平矩形 的DNA 折紙，其中 DNA-PAINT 對(duì)接位點(diǎn)呈網(wǎng)格狀，間距為 10 nm（圖 1b），并使用全內(nèi)反射熒光8 (TIRF) 顯微鏡對(duì)表面結(jié)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以以大約 1.5 nm 的精度定位，即為顯著的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（圖 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可編程性質(zhì)，多色圖像采集不僅限于光譜上的多重功能。一種稱(chēng)為 exchange-PAINT9 的方法，讓使用同一種性能最佳的熒光染料來(lái)進(jìn)行多重功能成像成為可能：成像鏈的 DNA 序列可以上偽色，其中每個(gè)正交序列代表一種獨(dú)特的顏色，然后按順序執(zhí)行圖像采集，可以使用洗滌緩沖液去除瞬時(shí)結(jié)合的成像鏈，并且可以引入新的“顏色”（例如具有不同序列的成像鏈）。
超分辨率1 技術(shù)使研究人員能夠以前所未有的精度在光的經(jīng)典衍射極限以下進(jìn)行成像。在實(shí)施單分子定位的過(guò)程中，分子在非熒光暗狀態(tài)（或關(guān)閉狀態(tài)）和熒光亮狀態(tài)（或開(kāi)啟狀態(tài)）之間“切換”，以便以亞衍射的精度選定和檢測(cè)它們的位置。通過(guò)獲取不僅單張而是一整疊圖像來(lái)構(gòu)建超分辨率圖像，其中在“開(kāi)啟狀態(tài)”中只記錄熒光分子的隨機(jī)子集（每幀都各不相同）。
圖 1：DNA 折紙的 DNA-PAINT 成像。(a) DNA-PAINT 原理：用熒光染料功能化的短寡核苷酸與位于靶標(biāo)的互補(bǔ) DNA 鏈（對(duì)接位點(diǎn)）瞬時(shí)結(jié)合。(b) 平面矩形 DNA 折紙用于 DNA-PAINT 成像，具有 4 x 4 網(wǎng)格圖案裝飾，間距 10 nm。(c) 用 DNA-PAINT 和 sCMOS 相機(jī) (pco.panda 4.2) 成像的 n = 24 的DNA 折紙的總覽圖像。比例尺：20 nm (a)。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬態(tài) DNA-DNA 相互作用。與 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他隨機(jī)方法相比，DNA-PAINT 技術(shù)中的熒光分子不會(huì)在暗態(tài)和亮態(tài)之間切換，所謂的“閃爍”是由短熒光 DNA 鏈與目標(biāo)的瞬時(shí)雜交（結(jié)合和解除結(jié)合）產(chǎn)生的（圖 1a）。一旦成像鏈結(jié)合到對(duì)接位點(diǎn)，熒光團(tuán)就會(huì)被固定，并且可以被相機(jī)檢測(cè)到。因?yàn)槌上矜準(zhǔn)莿?dòng)態(tài)補(bǔ)充的，所以 DNA-PAINT 不會(huì)受到光漂白的影響，這允許在與對(duì)接位點(diǎn)結(jié)合時(shí)提取固定成像鏈的全部光子容量，從而促成低至幾納米的卓越分辨率6。高信號(hào)背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)共聚焦顯微鏡7）相結(jié)合成為可能。我們用合成的 DNA 納米結(jié)構(gòu)測(cè)試了一款新的非制冷型科學(xué) CMOS 相機(jī) (pco.panda 4.2 bi)。因此，我們裝飾了一個(gè)扁平矩形 的DNA 折紙，其中 DNA-PAINT 對(duì)接位點(diǎn)呈網(wǎng)格狀，間距為 10 nm（圖 1b），并使用全內(nèi)反射熒光8 (TIRF) 顯微鏡對(duì)表面結(jié)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以以大約 1.5 nm 的精度定位，即為顯著的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（圖 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可編程性質(zhì)，多色圖像采集不僅限于光譜上的多重功能。一種稱(chēng)為 exchange-PAINT9 的方法，讓使用同一種性能最佳的熒光染料來(lái)進(jìn)行多重功能成像成為可能：成像鏈的 DNA 序列可以上偽色，其中每個(gè)正交序列代表一種獨(dú)特的顏色，然后按順序執(zhí)行圖像采集，可以使用洗滌緩沖液去除瞬時(shí)結(jié)合的成像鏈，并且可以引入新的“顏色”（例如具有不同序列的成像鏈）。
圖 2：細(xì)胞環(huán)境中的 DNA-PAINT 成像。(a) 微管用 α 微管蛋白一抗和 DNA 偶聯(lián)二抗標(biāo)記。使用非制冷型 sCMOS 相機(jī) (pco.panda 4.2) 在 TIRF 模式下進(jìn)行成像。(b) 衍射限制 (DL) 表示和圖 (c) a 中突出顯示區(qū)域的超分辨率 (SR) 放大。(d)圖 (c) 中標(biāo)記區(qū)域的橫截面直方圖顯示了三個(gè)微管中間纖維之間的距離。比例尺：5 μm (a), 500 nm (b, c)。
為了使用 DNA-PAINT 對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行成像，標(biāo)記探針（例如抗體 10、納米抗體 11 或 Affimers12）與作為對(duì)接位點(diǎn)的短 DNA 寡核苷酸結(jié)合。我們研究了非制冷型 sCMOS 相機(jī)在固定 COS7 細(xì)胞的細(xì)胞環(huán)境中的成像能力，其中 α 微管蛋白用一抗和二抗標(biāo)記（圖 2）。概覽（圖 2a）顯示了超分辨微管網(wǎng)絡(luò)。圖 2b 中衍射受限的放大面板與圖 2c 中的超分辨率放大面板的對(duì)比清楚地顯示了分辨率的增加，從而可以區(qū)分和測(cè)量單個(gè)微管蛋白纖維絲之間的距離（圖 2d）。顯然，非制冷型 sCMOS 相機(jī)非常適合使用 DNA-PAINT 方法進(jìn)行此類(lèi)超分辨率測(cè)量。
尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
【關(guān)于埃賽力達(dá)科技Excelitas Technologies Corp.】
埃賽力達(dá)是一家技術(shù)經(jīng)驗(yàn)豐富供應(yīng)商，致力于提供先進(jìn)的、改善生活的革新技術(shù)，為生命科學(xué)、先進(jìn)工業(yè)、新一代半導(dǎo)體、航空航天等各終端市場(chǎng)的全球企業(yè)提供服務(wù)。公司總部位于美國(guó)賓夕法尼亞州匹茲堡。埃賽力達(dá)是光子技術(shù)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)和制造領(lǐng)域的重要合作伙伴，為全球客戶提供傳感、檢測(cè)、成像、光學(xué)和特種光源方面的前沿創(chuàng)新技術(shù)。
廣州市元奧儀器有限公司作為埃賽力達(dá)在國(guó)內(nèi)的一級(jí)代理商，根據(jù)用戶的不同需求提供具備高性能、高質(zhì)量的產(chǎn)品，為客戶提供專(zhuān)業(yè)的方案，歡迎咨詢！
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尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
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