180微米深度高保真超分辨率成像重建圖像線性相關性高達92%
本研究成果由Qianxi Liang、Wei Ren、Boya Jin、Liang Qiao、Xichuan Ge、Yunzhe Fu、Xiaoqi Lv、Meiqi Li和Peng Xi共同完成，論文題為“High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy”，于2025年發表在《Light: Science & Applications》期刊。
重要發現
01光學系統設計與硬件實現
C2SD-ISM系統的核心在于其創新的光學配置，它巧妙融合了旋轉盤共聚焦顯微鏡和數字微鏡設備。旋轉盤被放置在樣本共軛平面上，通過物理方式實時移除離焦信號，從而減少背景干擾對后續重建過程的影響。數字微鏡設備則用于生成稀疏多焦點照明模式，這種照明方式通過程序化控制實現高效采樣。系統采用多模激光作為光源，并結合方形勻化光纖，確保照明均勻且無散斑。光學路徑中，樣本焦平面、旋轉盤針孔陣列、數字微鏡設備和sCMOS傳感器平面均處于共軛狀態，保證了成像的精確性。數字微鏡設備的衍射特性經過系統優化，入射角設置為26.3°，可在多色成像（如561nm、488nm和405nm波長）中實現超過95%的衍射效率，出口角差異控制在可接受范圍內，從而避免了視場偏差和照明不均問題。
旋轉盤的設計采用阿基米德螺旋排列的針孔陣列，通過電子束光刻和蝕刻工藝制成。為了提升成像速度，研究團隊開發了多同心螺旋設計（N>1），將全視場分為N個子區域進行并行掃描。理論表明，這種設計可將均勻照明速度提升N倍，例如當N=12時，曝光時間間隔縮短至原設計的1/12，從而簡化了與旋轉速度的同步操作。針孔直徑與間距的比值設置為50μm:250μm，以平衡信噪比和分辨率。實驗驗證表明，旋轉盤能有效增強成像對比度：在小鼠腎臟組織切片成像中，引入旋轉盤后，局部對比度提升約三倍，且多焦點照明模式下的信噪比和點信號清晰度顯著改善。這為后續算法重建提供了高質量輸入數據。
03DPA-PR重建算法的高保真實現
傳統圖像掃描顯微鏡重建通常基于理想點擴散函數假設，但實際系統中存在斯托克斯位移和光學像差，導致重建保真度下降。C2SD-ISM系統引入了動態針孔陣列像素重分配算法，該算法通過構建虛擬探測器陣列來模擬多視角成像。具體過程包括：首先定位照明光學軸，然后對原始圖像進行采樣和重組，生成25張共聚焦子圖像，最后通過相位互相關進行配準和疊加。重建結果進一步通過去卷積處理，實現近兩倍的分辨率提升。與常規像素重分配方法相比，DPA-PR算法能自適應校正非理想因素，重建圖像與衍射極限共聚焦圖像的峰值信噪比和結構相似性指數更高，線性相關性R²達到0.92，顯著降低了偽影。
04成像性能與生物應用驗證
通過模擬實驗和生物組織成像，C2SD-ISM系統展現了卓越的3D分辨率提升。在合成微管數據集中，引入旋轉盤后，DPA-PR重建的橫向分辨率提升至144納米，軸向分辨率達351納米，且結構細節更清晰。與計算背景去除算法（如滾動球和小波去噪）相比，旋轉盤的物理離焦信號去除能更好地保留樣本結構信息，實現更高的保真度。在實際生物樣本如小鼠腎臟切片中，系統在12微米厚度樣本上實現了高對比度成像，穿透深度達180微米。多色成像實驗進一步驗證了系統在tri-color標記樣本（如線粒體、F-肌動蛋白和細胞核）中的穩定性，視場均勻性無波長差異。此外，系統的高通量能力通過斑馬魚血管3D成像得到體現，拼接成像覆蓋2.91 mm x 1.26 mm x 0.18 mm體積，分辨率媲美高數值孔徑物鏡的共聚焦成像。
創新與亮點
C2SD-ISM系統的核心創新在于突破了深層組織超分辨率成像的多個技術難題。首先，通過雙共聚焦策略物理性消除離焦信號，解決了傳統計算方法導致的信號失真問題。旋轉盤技術的引入不僅提升了成像對比度，還保留了原始強度分布，為高保真重建奠定了基礎。其次，動態針孔陣列像素重分配算法克服了理想點擴散函數假設的局限性，能自適應校正斯托克斯位移和光學像差，實現近乎理論極限的分辨率提升。此外，數字微鏡設備的程序化控制使系統支持多模態成像，如投影式結構化照明顯微鏡，進一步擴展了應用場景。系統價值體現在其高通用性上：它兼具高分辨率（橫向144納米、軸向351納米）、大穿透深度（180微米）和高通量能力，適用于從細胞成像到組織尺度探索的多種生物研究需求。與現有技術相比，C2SD-ISM在保持高速成像的同時，顯著降低了光毒性和偽影，為活體動態過程研究提供了新可能。
總結與展望
C2SD-ISM系統通過集成旋轉盤共聚焦顯微鏡和數字微鏡設備，結合創新算法，成功實現了高保真深層組織超分辨率成像。該系統在分辨率、穿透深度和重建保真度方面均表現出色，為生物醫學研究提供了強大工具。未來，通過整合自適應光學技術，系統可進一步校正樣本誘導像差，提升在復雜生物結構中的成像精度。長波長熒光探針和非線性激發策略（如雙光子吸收）的引入，有望減少散射和自發熒光，擴展穿透深度。此外，深度學習算法的應用可優化重建過程，降低數據采集需求，實現實時超分辨率成像。C2SD-ISM平臺的靈活性和可擴展性使其在動態生物過程觀測和大規模生物研究中具有廣闊前景，有望深化我們對復雜生物系統的理解。
聲明：本文僅用作學術目的。
Liang Q, Ren W, Jin B, Qiao L, Ge X, Fu Y, Lv X, Li M, Xi P. High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy. Light Sci Appl. 2025 Aug 4;14(1):260.
DOI:10.1038/s41377-025-01930-x.
