自由移動動物雙光子成像：新型顯微鏡實時三維運動校正功能
這項研究名為“Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal”，由Paul McNulty、Rui Wu、Akihiro Yamaguchi、Ellie S. Heckscher、Andrew Haas、Amajindi Nwankpa、Mirna Mihovilovic Skanata和Marc Gershow共同完成。該論文于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在線發表。這項工作不僅解決了運動偽影的難題，還首次在自由爬行的果蠅幼蟲中實現了細胞分辨率的功能成像，揭示了先前未知的神經行為關聯。
重要發現
01CRASH2p顯微鏡的技術原理與實現
本研究核心貢獻是開發了閉環諧振軸向掃描高速雙光子（CRASH2p）顯微鏡，能夠在自由移動動物中實現實時三維運動校正的體積功能成像。傳統雙光子顯微鏡對運動高度敏感，且需物理連接限制動物行為，而CRASH2p通過雙掃描頭設計（跟蹤頭和成像頭）實現了無創成像。跟蹤頭使用1070納米脈沖激光專用于跟蹤單個參考神經元（通過鈣不敏感紅色熒光蛋白mCherry標記），通過圓柱形掃描和卡爾曼濾波實時估計神經元位置，并以亞毫秒延遲和亞微米精度反饋至成像系統。成像頭則采用920納米激光激發綠色鈣指示劑（如GCaMP6f），并結合“Pong”掃描策略進行體積成像。Pong掃描通過三角波驅動x和y軸掃描器，替代傳統光柵掃描，消除了慢軸問題，使采樣更均勻分布，有助于校正旋轉和變形。雙色成像允許通過紅色通道校正運動引起的熒光變化，確保綠色信號準確反映神經活動。
實驗在自由爬行的果蠅幼蟲中進行，幼蟲在瓊脂糖包被的蓋玻片上爬行，顯微鏡通過實時跟蹤參考神經元來穩定成像體積。研究重點關注了幼蟲腹神經索（VNC）中的節段重復中間神經元，如A27h premotor神經元和Even-skipped+ lateral（EL）本體感覺神經元。通過雙色標記（GCaMP6f/mCherry），CRASH2p記錄了在前進和后退爬行期間的神經活動。成像數據經過多階段配準管道處理：先校正剛性運動（旋轉和平移），再通過B樣條基自由形變校正非剛性變形，最后應用強度校正以消除空間不均一熒光變化。結果顯示，在前進爬行時，A27h神經元的中央過程呈現后前傳播的活動波，而在后退爬行時活動被抑制；相反，M神經元（與A27h形態相近）在后退爬行時表現活躍。這些發現通過主成分分析（PCA）進一步驗證，顯示活動波具有解剖特異性，且綠色熒光變化與行為同步，而紅色通道無類似模式，排除了運動偽影。
03光學成像技術的優勢與驗證
CRASH2p的光學設計顯著提升了成像性能。雙光子激發減少了散射和脫靶熒光的影響，而閉環跟蹤補償了平移運動。Pong掃描策略通過高頻采樣（如400 kHz軸向線速率）實現了10 Hz體積成像速率，確保在毫米/秒級運動下保持微米級分辨率。此外，時間多路復用技術將跟蹤和成像路徑的紅色光子分離，避免了串擾。實驗還通過對照組（如GFP標記的幼蟲）驗證了信號特異性：在GCaMP標記的動物中，旅行波表示解釋了大部分方差，而GFP對照組無此現象，證實了鈣指示劑的動態響應。這些技術使得在自由行為中首次觀察到EL神經元在前進爬行時的活動波，以及Mooncrawler Descending Neuron（MDN）在后退爬行時的活動增強，突出了細胞分辨率成像的重要性。
創新與亮點
01突破傳統成像難題
CRASH2p顯微鏡突破了自由移動動物中雙光子成像的長期難題。傳統方法受限于運動偽影，尤其是昆蟲等小動物，其大腦在行為中會發生劇烈變形。本研究通過實時閉環跟蹤，無需植入標記物即可補償三維平移，結合Pong掃描和非剛性配準，校正了旋轉和變形，實現了在果蠅幼蟲中的穩定體積成像。這解決了單光子成像中散射敏感和雙光子成像中運動敏感的權衡問題，為研究自然行為下的神經電路提供了新途徑。
技術亮點包括雙掃描頭設計、諧振TAG透鏡軸向掃描和時間多路復用檢測。Pong掃描作為關鍵創新，通過三角波驅動替代正弦Lissajous掃描，提高了采樣均勻性，減少了運動失真。多階段配準管道結合了剛性校正、B樣條形變和強度平滑，確保熒光比率計量的準確性。這些技術使得成像速度達10 Hz體積速率，在200毫秒內完成200×200×50微米體積采樣，同時保持細胞分辨率。此外，雙色成像策略通過紅色參考通道校正了光學路徑變化，提升了信號可靠性。
03科學價值與應用前景
CRASH2p的價值體現在推動模型生物研究上。果蠅幼蟲作為系統神經科學模型，具有遺傳工具豐富、神經元可識別和全腦連接組圖譜完整等優勢，但此前難以在自由行為中記錄活動。本研究不僅發現了A27h和M神經元在相反行為模式中的分工，還證實了EL神經元的本體感覺角色，為運動控制和本體感覺研究提供了新見解。技術通用性高，可擴展至其他小動物或厚組織成像，潛在應用包括行為神經科學、疾病模型和光學遺傳學操縱。
總結與展望
CRASH2p顯微鏡的成功開發標志著自由移動動物中雙光子功能成像的重大進步，通過實時運動校正和體積成像，實現了細胞分辨率的神經活動記錄。這項技術不僅克服了傳統成像的運動限制，還揭示了果蠅幼蟲VNC中節段神經元的動態活動波，為理解行為控制的神經基礎提供了新證據。未來，該技術可進一步優化，如集成旋轉跟蹤以提升校正能力，或結合高速成像技術（如FACED或LBM）實現更高幀率。此外，擴展至密集標記組織或其他模型生物將拓寬其在神經科學中的應用。總之，CRASH2p為研究自然行為下的全腦活動開辟了新道路，有望推動精準神經環路解析和行為學研究的發展。
聲明：本文僅用作學術目的。
McNulty P, Wu R, Yamaguchi A, Heckscher ES, Haas A, Nwankpa A, Skanata MM, Gershow AM. Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5950.
DOI:10.1038/s41467-025-60648-x.
