共聚焦顯微鏡高分辨率成像揭示腦瘧致血管滲漏新靶點(diǎn)

本研究成果由Livia Piatti, Alina Batzilla, Fumio Nakaki, Hannah Fleckenstein, Francois Korbmacher, Rory K. M. Long, Daniel Schraivogel, John A. Hawkins, Tais Romero-Urunuela, Borja Lopez-Gutiérrez, Silvia Sanz Sender, Yannick Schwab, Lars M. Steinmetz, James Sharpe & Maria Bernabeu共同完成，并以"Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model"為題，于2025年8月在線發(fā)表在《Nature Communications》期刊上。

技術(shù)原理
本研究核心技術(shù)的獨(dú)特機(jī)制在于構(gòu)建了一個(gè)高度仿生的三維微血管系統(tǒng)。該技術(shù)通過(guò)軟光刻和注射成型相結(jié)合的方法，在I型膠原水凝膠中預(yù)圖案化生成微流控13×13網(wǎng)格網(wǎng)絡(luò)，創(chuàng)造了復(fù)雜的微流體通道結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵技術(shù)原理包含三個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)：首先采用多細(xì)胞共培養(yǎng)策略，將原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管周細(xì)胞預(yù)先種植在膠原溶液中，形成支持基質(zhì)，而后在原代人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在重力驅(qū)動(dòng)流下接種到微流控網(wǎng)絡(luò)中，形成完整的三維結(jié)構(gòu)；其次利用先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證，通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)特異性標(biāo)志物（PECAM-1、vWF、VE-cadherin用于內(nèi)皮細(xì)胞，PDGFRβ、NG2用于周細(xì)胞，GFAP、S100B、AQP4用于星形膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行成像，確認(rèn)各種細(xì)胞的正確定位和形態(tài)特征；第三是建立功能評(píng)估體系，通過(guò)70 kDa FITC-葡聚糖通透性實(shí)驗(yàn)定量評(píng)估屏障完整性，證明該模型相比內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)模型具有顯著降低的通透性（2.15×10⁻⁶ cm/s vs 8.31×10⁻⁶ cm/s），證實(shí)其增強(qiáng)的屏障特性。

重要發(fā)現(xiàn)
01三維血腦屏障模型的構(gòu)建與優(yōu)越的屏障特性
研究團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了一個(gè)更接近人體真實(shí)生理狀態(tài)的生物工程化3D微血管模型。該模型在I型膠原水凝膠中制造，通過(guò)軟光刻和注射成型技術(shù)預(yù)圖案化形成一個(gè)微流控網(wǎng)絡(luò)。將原代人星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管周細(xì)胞預(yù)先種植在膠原溶液中，再將原代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在重力驅(qū)動(dòng)流下接種到微流控網(wǎng)絡(luò)中，從而形成了一個(gè)三維共培養(yǎng)體系。經(jīng)過(guò)免疫熒光染色鑒定，三種細(xì)胞均表達(dá)了其特有的標(biāo)志物：內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PECAM-1、vWF、VE-cadherin和β-catenin；周細(xì)胞表達(dá)PDGFRβ和NG2；星形膠質(zhì)細(xì)胞則表達(dá)GFAP、S100B和AQP4。共聚焦顯微鏡成像顯示，內(nèi)皮細(xì)胞形成了可灌注的微血管，并被星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞包裹，再現(xiàn)了體內(nèi)BBB的三維結(jié)構(gòu)和架構(gòu)。

該模型的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于其顯著增強(qiáng)的屏障功能。定量RT-PCR測(cè)量顯示，與星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞以7:3比例共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞中BBB特異性標(biāo)志物的表達(dá)隨時(shí)間增加，包括緊密連接標(biāo)志物（OCLN, CLDNs）、BBB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LRP1, SLC家族）和外排泵（PGP, ABC家族），并在培養(yǎng)7天后達(dá)到峰值。功能實(shí)驗(yàn)證明，含有周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的3D-BBB模型對(duì)70 kDa FITC-葡聚糖的通透性顯著降低，其通透性值（2.15x10⁻⁶ cm/s）顯著低于僅含內(nèi)皮細(xì)胞的模型（8.31x10⁻⁶ cm/s）。這種增強(qiáng)的屏障特性為研究惡性瘧原蟲(chóng)誘導(dǎo)的血管屏障破壞機(jī)制提供了獨(dú)特而可靠的平臺(tái)。

scRNA-seq分析揭示了暴露于iRBC-逸出介質(zhì)后，三種細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生了轉(zhuǎn)變。內(nèi)皮細(xì)胞的差異基因表達(dá)分析顯示，多個(gè)對(duì)BBB完整性至關(guān)重要的基因表達(dá)顯著降低，包括緊密連接基因CLDN5（Claudin-5）、TJP1（ZO-1）和粘附連接轉(zhuǎn)錄本CDH5（VE-cadherin）。基因本體（GO-term）富集分析表明，內(nèi)皮細(xì)胞中大多數(shù)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本與內(nèi)皮細(xì)胞連接和粘附、細(xì)胞骨架組織、血管發(fā)育、DNA修復(fù)、染色質(zhì)組織和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

這些轉(zhuǎn)錄變化直接導(dǎo)致了形態(tài)和功能的改變。透射電鏡（TEM）分析顯示，雖然完整細(xì)胞接觸區(qū)域的緊密連接長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異，但暴露于iRBC-逸出介質(zhì)的3D-BBB微血管中，超結(jié)構(gòu)間隙的百分比顯著更高。共聚焦顯微鏡觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)，VE-cadherin染色顯示出改變的粘附連接模式，表現(xiàn)為連接染色變細(xì)和大規(guī)模的內(nèi)皮間縫隙形成。功能上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)處理后，3D-BBB微血管對(duì)70 kDa FITC-葡聚糖的微血管通透性比率顯著增加了6.5倍。這些結(jié)果強(qiáng)有力地表明，惡性瘧原蟲(chóng)-iRBC產(chǎn)物降低了緊密連接和粘附連接標(biāo)志物的表達(dá)，改變了細(xì)胞間連接的形態(tài)，并導(dǎo)致了血管屏障完整性的功能損害。

上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本包括參與I型干擾素（IFN）反應(yīng)的基因，如IFIT基因家族成員（IFIT1, IFIT2, IFIT3）、干擾素刺激基因（ISGs）（如ISG15, ISG20）和其他IFN誘導(dǎo)基因（如MX1, IFI6, IFI27, OAS1），以及ferroptosis基因（如HMOX1）。此外，JAK-STAT家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子（STAT1, STAT2, JAK2）及其一些相互作用蛋白的轉(zhuǎn)錄本也被上調(diào)。

抗原呈遞是一個(gè)在所有BBB組成細(xì)胞中強(qiáng)烈 elevated 的重要炎癥相關(guān)過(guò)程。TEM證據(jù)顯示內(nèi)皮細(xì)胞存在攝取寄生蟲(chóng)物質(zhì)的跡象，形成了含有iRBC膜或hemozoin的大空泡。免疫熒光染色顯示寄生蟲(chóng)核酸與溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）共定位，表明寄生蟲(chóng)物質(zhì)被運(yùn)送到了內(nèi)皮細(xì)胞的溶酶體區(qū)室。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步定義了抗原呈遞的轉(zhuǎn)錄組基因特征（MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)轉(zhuǎn)錄本）。內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均表現(xiàn)出MHC I類(lèi)基因特征的強(qiáng)勁上調(diào)，而MHC II類(lèi)抗原呈遞基因特征（與CD4+ T細(xì)胞招募相關(guān)）也在內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)烈上調(diào)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞中適度上調(diào)。

為了更深入了解信號(hào)通路的變化，團(tuán)隊(duì)使用了PROGENy計(jì)算方法來(lái)基于下游基因表達(dá)推斷信號(hào)通路活性。結(jié)果與GO-term分析一致，觀察到NFkB和TNFα信號(hào)在內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中的增加。值得注意的是，JAK-STAT通路在所有細(xì)胞類(lèi)型中均被激活。通過(guò)免疫熒光染色對(duì)STAT1的驗(yàn)證表明，與對(duì)照組相比，暴露于寄生蟲(chóng)逸出產(chǎn)物后，3D-BBB模型中STAT1表達(dá)增加，且不僅發(fā)生在于內(nèi)皮細(xì)胞，也發(fā)生在膠原水凝膠中的支持周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中，表明模型對(duì)iRBC-逸出介質(zhì)產(chǎn)生了整體反應(yīng)。在2D單層細(xì)胞中進(jìn)一步評(píng)估了STAT1向核的易位，作為通路活性增加的代理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞核STAT1定位增加。

更重要的是，這些形態(tài)學(xué)上的改善與3D-BBB屏障功能的改善相關(guān)。通過(guò)70 kDa FITC-葡聚糖灌注評(píng)估微血管通透性發(fā)現(xiàn)，雖然Ruxolitinib在對(duì)照組中僅 modestly 改善了基線通透性，但其在病理?xiàng)l件下的影響更為顯著。與iRBC-逸出介質(zhì)共同孵育導(dǎo)致微血管通透性比單獨(dú)使用iRBC-逸出介質(zhì)條件降低了近24倍。這些結(jié)果凸顯了JAK-STAT通路在惡性瘧原蟲(chóng)介導(dǎo)的屏障破壞中的重要性，并支持了Ruxolitinib在減少與腦瘧疾相關(guān)的腦血管功能障礙方面的治療潛力。

挑戰(zhàn)與展望
當(dāng)前三維血腦屏障模型雖顯著優(yōu)于傳統(tǒng)模型，但仍面臨多項(xiàng)臨床轉(zhuǎn)化障礙。模型構(gòu)建復(fù)雜且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行長(zhǎng)期培訓(xùn)，限制了其廣泛推廣；盡管屏障特性有所改善，但與原生理通透率仍有差距，這主要與原代內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白如Claudin-5和Occludin的固有低表達(dá)有關(guān)。

未來(lái)研究方向應(yīng)聚焦于技術(shù)優(yōu)化與創(chuàng)新，包括采用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來(lái)源的腦內(nèi)皮細(xì)胞提升屏障性能，但需解決其上皮樣特性問(wèn)題，通過(guò)過(guò)表達(dá)ETV2、FLI1、ERG等ETS因子或FOXF2和ZIC3等轉(zhuǎn)錄因子可改善血管表型；模型復(fù)雜性也需進(jìn)一步增強(qiáng)，引入小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等其他腦細(xì)胞類(lèi)型，以及免疫細(xì)胞和血流剪切力等生理因素，以更全面模擬體內(nèi)環(huán)境。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Piatti L, Batzilla A, Nakaki F, Fleckenstein H, Korbmacher F, Long RKM, Schraivogel D, Hawkins JA, Romero-Uruñuela T, López-Gutiérrez B, Sanz Sender S, Schwab Y, Steinmetz LM, Sharpe J, Bernabeu M. Plasmodium falciparum egress disrupts endothelial junctions and activates JAK-STAT signaling in a microvascular 3D blood-brain barrier model. Nat Commun. 2025 Aug 6;16(1):7262. 

DOI:10.1038/s41467-025-62514-2.