《Light》：“鏡像”光場成像亞細胞突破各向同性分辨率極限
研究團隊在國際頂級光學期刊《Light : Science & Applications》上發表了題為《Mirror-enhanced scanning light-field microscopy for long-term high-speed 3D imaging with isotropic resolution》的研究論文。這項由Bo Xiong（熊博）、Tianyi Zhu（朱天奕）、Jiamin Wu（吳嘉敏）、Qionghai Dai（戴瓊海）等共同完成的工作，首次實現了在單物鏡、低光照條件下，對活體樣本進行小時級毫秒分辨率、各向同性400納米的三維動態觀測。
重要發現
01軸向分辨率突破性提升
“缺失錐”難題的破解：
傳統光場顯微鏡（LFM）因光學傳遞函數的“缺失錐”問題，軸向分辨率（約1.5μm）遠低于橫向分辨率（約0.4μm），導致Z軸圖像模糊（圖1b）。MiSLFM的核心創新在于利用樣本下方傾斜放置的鏡面（圖1a）。樣本發出的熒光被鏡面反射后再次被物鏡捕獲，相當于在單次曝光內同時獲取了樣本的原始視圖和其鏡像視圖。
鏡像約束算法：
團隊開發了多視角相位空間反卷積算法（圖1c）。該算法首先進行初始三維重建，然后精確估計鏡面位置，最后在反卷積過程中強制施加原始圖像與鏡像圖像的對稱性約束。這種計算策略充分利用了鏡像視圖提供的額外空間頻率信息，有效填補了傳統LFM的“缺失錐”。
各向同性分辨率實現：
通過對亞衍射極限熒光珠（40倍/0.8NA物鏡）成像驗證，MiSLFM在橫向和軸向上均實現了約0.4μm的分辨率（圖S2）。模擬實驗（圖1d,e）和不同角度鏡面測試（圖S3）進一步證實，在鏡面傾斜45°時，軸向分辨率達到最佳，與橫向分辨率相當，真正實現了三維各向同性成像。實際細胞成像（L929細胞膜染色，圖1b；NRK細胞膜與線粒體雙色成像，圖2a-c）清晰顯示，MiSLFM能分辨細胞間精細的膜接觸結構（圖2b紅箭頭）和線粒體的清晰軸向分布（圖2c黃箭頭），這是傳統sLFM無法做到的。
光子回收站：
傾斜鏡面不僅提供額外視角，還將原本逸失的樣本下方熒光反射回物鏡，理論上使有效收集光子數翻倍。這意味著在達到相同信噪比時，MiSLFM僅需傳統sLFM一半的激發光強度（圖2,4,5）。
毫瓦級超低光照成像：
在NRK活細胞（膜-線粒體雙標）實驗中，MiSLFM在3.95mW/mm²(488nm)和1.99mW/mm²(561nm)的低光強下，以2Hz體積速率連續成像20分鐘。線粒體通道熒光強度幾乎無衰減，細胞膜通道僅衰減10%（圖2e）。
14小時細胞活性追蹤：
在更嚴苛的B16-GFP細胞長時程實驗中，MiSLFM僅使用0.22mW/mm²(488nm)光強，每6分鐘成像一次（每次曝光2.25秒），持續記錄14小時（圖3）。細胞保持良好活性，細胞間接觸穩定存在（圖3c）。相比之下，相同條件下共聚焦顯微鏡（0.44mW/mm²，但掃描時間長）僅能維持3小時成像，且細胞在11小時內出現嚴重光漂白（>90%衰減，圖S4），細胞形態變圓、接觸消失。MiSLFM顯著降低了光損傷，為研究緩慢生物過程（如細胞分裂、遷移）提供了可能。
光敏感細胞的高速捕捉：
盤基網柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）對光極度敏感且運動迅速。MiSLFM在1.71mW/mm²(488nm)和1.55mW/mm²(561nm)光強下，以2Hz體積速率成功捕捉其快速爬行（圖4）。得益于軸向分辨率的提升，MiSLFM清晰分辨了收縮泡（圖4b黃箭頭）在Z軸上的運動軌跡以及遠離鏡面的細胞膜上緣的動態（圖4c紅箭頭），而傳統sLFM對此無能為力。
斑馬魚血流毫秒級追蹤：
在體成像挑戰更大。MiSLFM使用20倍/0.5NA水浸物鏡，在0.54mW/mm²(488nm,血管)和0.71mW/mm²(561nm,血細胞)的超低光強下，以18Hz體積速率（相機幀頻18Hz，結合3x3掃描與滑動窗口重建）對3天斑馬魚幼體尾部血流進行成像（圖5a,b）。MiSLFM清晰呈現了血管壁在軸向的分布（圖5c），并對高速流動的血細胞實現了各向同性分辨率成像（圖5e,g）。自動追蹤（Imaris軟件）結果顯示，在相同區域內，MiSLFM檢測到的血細胞數量（8個）遠多于sLFM（2個）（圖S5），證明了其在活體高速三維追蹤中的魯棒性和準確性。
創新與亮點
01單物鏡攻克缺失錐
僅需在現有寬場顯微鏡上加裝一面定制角度的鏡片和樣品腔，無需復雜多物鏡光路（如4Pi顯微鏡、多視角光片顯微鏡），即利用光場顯微鏡固有的大景深特性，通過鏡面反射天然生成正交的第二視角，從根本上解決了傳統LFM軸向分辨率低的核心缺陷，首次在單物鏡系統中實現近各向同性分辨率（~400nm）。
鏡面充當“光子回收站”，將向下發射的熒光反射回物鏡，有效收集光子數翻倍。結合光場成像本身的高光子效率，MiSLFM在毫瓦級超低光強下即可獲得高質量圖像，將光毒性和光漂白降至極低水平，解鎖了小時級甚至十幾小時的長時程活體觀測，尤其適用于光敏感樣本和長期動態研究。
03高速與分辨率的統一
繼承掃描光場顯微（sLFM）的毫秒級三維成像速度，并通過鏡像約束算法有效抑制反卷積偽影。成功應用于快速運動的細胞器（如收縮泡）、高速血流等傳統方法難以清晰捕捉的動態過程，為生命活動的瞬時三維機制研究提供了利器。
其設計簡潔，成本相對較低，理論上可作為模塊兼容于現有正置熒光顯微鏡。這種“硬件簡化+計算增強”的策略，為開發新一代低成本、高性能、易普及的生物醫學成像設備指明了方向。
總結與展望
鏡面增強掃描光場顯微技術（MiSLFM）通過一項看似簡單卻極為巧妙的鏡面設計，結合強大的計算成像算法，成功打破了高速三維活體成像在分辨率、速度與光毒性之間的傳統權衡。它首次在單物鏡系統中實現了長時程（小時級）、高速度（毫秒級）、低光毒（毫瓦級光照）下的三維各向同性分辨率成像，為觀測細胞器相互作用、囊泡運輸、細胞間通訊、胚胎發育、神經活動以及高速血流動力學等生命活動的三維動態全景打開了前所未有的窗口。
未來，MiSLFM技術有望在多個方向深化發展：優化鏡面角度設計與樣品腔以適應更高NA物鏡和更厚組織成像；開發更快速、更智能的重建算法以處理更大規模數據；探索其在腦科學（全腦神經活動圖譜繪制）、免疫學（免疫細胞在體三維追蹤）、藥物篩選（長時程藥效評估）等領域的廣泛應用。這項源自中國的原創技術，不僅推動了光學顯微成像領域的進步，更將為生命科學和醫學研究帶來革命性的觀測工具，助力人類更深入地解碼生命的立體奧秘。
一面鏡子，照見生命最深處的奧秘；一項創新，打開微觀世界的新窗口。這項源自中國的技術突破，正引領全球生物成像進入三維超清時代。
顯微鏡前的你，準備好迎接這場分辨率革命了嗎？
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
Xiong B, Zhu T, Xiang Y, Li X, Yu J, Jiang Z, Niu Y, Jiang D, Zhang X, Fang L, Wu J, Dai Q. Mirror-enhanced scanning light-field microscopy for long-term high-speed 3D imaging with isotropic resolution. Light Sci Appl. 2021 Nov 4;10(1):227.
DOI:10.1038/s41377-021-00665-9.
