組織透明3D成像可視化胚胎與胎盤發育的技術創新及應用

在生命科學領域，對器官三維結構的精準解析一直是探索生理與病理機制的核心目標。傳統組織學方法依賴二維切片重建，難以完整保留器官結構且易受操作變形影響。而新興的組織透明化技術結合光片顯微鏡，為解決這一難題提供了全新路徑。2017年發表于《Scientific Reports》的一項研究，通過改良的CUBIC組織透明化方法，成功實現了小鼠子宮內胚胎與胎盤的三維可視化，為深入理解胎盤發育及相關疾病機制奠定了基礎。

研究背景與技術挑戰
傳統組織學方法的局限性
在該研究之前，科研人員主要依靠傳統的組織切片和染色技術來分析子宮和胎盤的結構。這些方法需要制備大量連續的薄組織切片，然后通過染色來觀察細胞和組織結構。然而，這種方法存在明顯的局限性。首先，在切片過程中，組織很容易發生變形。其次，染色過程也可能破壞組織的完整性。染色劑可能無法均勻地滲透到組織的各個部分，導致某些區域的染色效果不佳，影響對細節的觀察。此外，通過二維切片來重建三維結構是一項非常復雜且耗時的工作。因此，傳統方法在分析子宮和胎盤的三維結構時面臨著巨大的挑戰。

子宮與胎盤的結構特殊性
子宮和胎盤的結構具有很強的特殊性，這使得傳統的成像方法難以有效應用。子宮是一個肌肉豐富的器官，其肌肉組織的存在會對光線的穿透造成阻礙。而胎盤則是一個血管密集的器官，富含血液和血管，這使得光線在穿透胎盤時會被大量吸收和散射，導致成像效果不佳。具體來說，子宮的肌肉組織中含有大量的肌紅蛋白，而胎盤的血管中含有大量的血紅蛋白。這些色素分子會吸收特定波長的光線，使得傳統的光學成像技術難以穿透這些組織，從而無法獲取清晰的內部結構圖像。

技術創新與應用
CUBIC方法的改良與優勢
在這項研究中，科研人員選擇了CUBIC方法，并對其進行了改良，以適應子宮和胎盤的特殊結構。CUBIC方法的核心在于其獨特的試劑配方，能夠有效地去除組織中的色素分子，如血紅蛋白和肌紅蛋白，同時保持組織的完整性和熒光標記的穩定性。

CUBIC試劑由多種成分組成，這些成分相互作用，能夠溶解和去除組織中的脂類和色素，同時保持組織的三維結構。與其他組織透明化方法相比，CUBIC方法具有明顯的優勢。首先，它能夠高效地去除子宮和胎盤中的血紅蛋白和肌紅蛋白，使組織變得透明，從而允許光線穿透，進行三維成像。其次，CUBIC方法對組織的損傷較小，能夠較好地保持組織的結構和抗原性，為后續的免疫組織化學染色等分析提供了可能。此外，CUBIC方法的處理時間相對較短，能夠在較短的時間內完成組織透明化處理，提高了實驗效率。

光片顯微鏡的優勢在于其能夠在較短的時間內獲取高分辨率的三維圖像，同時對樣本的損傷較小。這使得它非常適合用于對活體樣本或脆弱的組織樣本進行成像。在這項研究中，光片顯微鏡被用于對透明化的子宮和胎盤進行成像，成功獲取了胚胎和胎盤的三維結構圖像，為后續的分析提供了高質量的數據。

成像實驗與結果分析
實驗流程與關鍵步驟
樣本制備：實驗選用了不同孕期的小鼠子宮和胎盤作為研究對象。首先，對小鼠進行深度麻醉，然后通過心臟灌注4%多聚甲醛（PFA）/磷酸鹽緩沖液（PBS）和碘化丙啶（PI）溶液，對組織進行固定和染色。固定完成后，將子宮和胎盤組織分離出來，進一步在4%PFA中浸泡過夜，以確保組織充分固定。

CUBIC透明化處理：將固定好的組織浸泡在CUBIC-1試劑中，在37°C下溫和振蕩處理3天。之后更換新鮮的CUBIC-1試劑，繼續處理2天。這一步驟的目的是去除組織中的脂類和色素，使組織變得透明。處理完成后，用PBS對組織進行3次清洗，每次清洗在室溫下溫和振蕩進行。接著，將組織浸泡在20%蔗糖的PBS溶液中1天，進行脫水處理。最后，將組織浸泡在CUBIC-2試劑中2天，進一步優化組織的透明度和折射率。

光片顯微鏡成像：將透明化處理后的組織樣本置于光片顯微鏡下進行成像。使用物鏡獲取整個生殖器官的整體圖像、具有單細胞分辨率的詳細圖像。在成像過程中，使用638nm的激發波長來激發組織中的自發熒光信號，同時結合PI和EGFP的熒光標記，獲取高質量的三維圖像。

圖像分析與處理：使用ZEN軟件對獲取的三維圖像進行分析和處理。通過三維重建和圖像處理技術，科研人員能夠從不同角度觀察子宮和胎盤的結構，獲取各種截面圖像，并進行定量分析。

細胞核與特定細胞的定位：利用PI染色，科研人員成功標記了子宮和胎盤中的細胞核。通過三維成像，可以清晰地看到細胞核在組織中的分布情況，以及細胞的排列方式。此外，結合EGFP轉基因小鼠，科研人員能夠特異性地標記胚胎和胎盤的特定細胞，如滋養層細胞。通過觀察EGFP標記的細胞，科研人員能夠追蹤這些細胞在子宮內的遷移路徑，以及它們與母體組織的相互作用。

免疫組織化學驗證：為了驗證成像結果的準確性，科研人員對透明化的組織樣本進行了免疫組織化學染色。他們選擇了血管內皮標記物CD31和滋養層標記物細胞角蛋白-7（CK7）進行染色。在染色后的組織切片中，能夠清晰地觀察到CD31和CK7的陽性信號，這表明CUBIC透明化處理并沒有破壞組織的抗原性，為后續的免疫組織化學分析提供了可能。

總結與展望
通過改良CUBIC組織透明化技術與光片顯微鏡結合，首次實現了小鼠子宮內胚胎與胎盤的三維可視化，突破了傳統組織學方法的局限。研究發現，優化后的CUBIC方案能有效消除子宮肌紅蛋白和胎盤血紅蛋白的干擾，保留組織完整性，并通過PI染色和EGFP轉基因技術實現細胞核與特定細胞的精準定位。光片顯微鏡的應用進一步提供了單細胞分辨率的三維成像能力，揭示了胚胎與胎盤在子宮內的空間分布及動態發育過程，為胎盤血管重塑、滋養層細胞侵襲等關鍵機制研究奠定了基礎。

然而，PI在胚胎深部的染色效率不足，晚期胎盤組織的成像分辨率有待提升，且人類樣本的適用性尚未驗證。未來研究可聚焦于技術優化，開發更高效的染色策略（如原位雜交或新型熒光探針），提升深層組織標記效果，探索CUBIC與超分辨顯微鏡的結合，突破光學衍射極限。

Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M. et al. Three-dimensional visualization of intrauterine conceptus through the uterine wall by tissue clearing method. Sci Rep 7, 5964 (2017).

DOI:10.1038/s41598-017-06549-6.