腦瘤研究新突破：整體透明空間3D成像照亮微觀世界

在人類與疾病斗爭的漫長歷史中，腦瘤始終是一塊難啃的 “硬骨頭”。其中，膠質母細胞瘤（GBM）作為一種極為兇險的腦部腫瘤，嚴重威脅著患者的生命，給無數家庭帶來了沉重的負擔。盡管現代醫學在諸多領域取得了長足進步，但膠質母細胞瘤的高侵襲性和復雜性，使其治療成為醫學領域的重大挑戰。

VU大學研究團隊發表于《Angiogenesis》的“Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment”研究文章，提出了腦部腫瘤組織的整體組織透明、3D成像和3D空間定量統計分析的工作流程，為腦部腫瘤研究帶來了全新的思路和方法。

研究背景
1、膠質母細胞瘤的挑戰
GBM是一種極具侵襲性的腦部腫瘤，其難治性部分歸因于腫瘤細胞廣泛而彌漫地浸潤周圍微環境。這種浸潤改變了腦內的微血管結構、組織灌注以及大腦整體架構，導致腫瘤與微環境之間的關系錯綜復雜。深入理解GBM細胞在空間上的異質性及其與微血管、血管間組織微環境的相互關系，對于攻克這一疾病至關重要，而這迫切需要更先進的三維分析技術來研究腦部腫瘤組織。

2、現有成像技術的局限
在腦部腫瘤研究中，光學3D分析技術雖然有望在細胞分辨率下對腦結構成像，成為連接CT、PET、MRI與傳統顯微組織學和免疫組織化學的橋梁，但傳統的活體共聚焦顯微鏡技術卻存在諸多不足。動物的鎮靜時間、有限的成像深度、狹小的視野以及熒光標記相關的限制等因素，都制約了其在深入研究中的應用。盡管如此，體外光學成像技術的出現為研究提供了新的方向，其不受活體成像中部分因素的限制，為更精準地研究腦部腫瘤微環境帶來了可能。

3、光學切片技術的興起
長期以來，3D結構的光學成像依賴于組織切片技術，但這一過程需要獲取并精確對齊大量組織切片，操作極為繁瑣且容易出錯。隨著技術的發展，光學切片技術應運而生，該技術通過透明組織使其“光學穿透”，從而實現深層組織的熒光激發和檢測。同時，多光子顯微鏡和光片顯微鏡等設備的改進，以及ImageJ、Amira和Imaris等軟件工具的開發，也為光學切片技術的廣泛應用奠定了基礎。

研究方法
1、動物實驗準備
動物模型建立、活體成像操作及光聲成像評估。

2、整體組織透明與標記方法
CLARITY和iDISCO兩種整體組織透明方法。

3、圖像采集與處理
使用多種顯微鏡進行圖像采集，利用FIJI軟件對雙光子圖像進行重建分析。

與其他方法的比較
1、活體成像的深度限制
研究人員通過在小鼠顱骨上應用顱窗并利用雙光子成像技術，對小鼠腦微血管進行了活體成像研究。實驗發現，盡管通過該窗口能夠清晰識別用于定位的淺表血管，但成像深度卻十分有限，最大僅能達到200μm。這一深度遠遠不足以深入研究腦內相關區域，因此促使研究團隊尋求更有效的體外成像方法，以更好地觀察和量化腫瘤細胞與腦微環境之間的關系，特別是聚焦于腦部腫瘤血管系統。

2、體外成像的顯著優勢
為了實現對整個小鼠腦區域的微觀可視化，研究采用了CLARITY和iDISCO兩種整體組織透明方法對小鼠腦組織進行處理。CLARITY方法使組織尺寸擴張約1.5倍，而iDISCO方法則導致組織直徑穩定收縮約1.2倍。在對經CLARITY處理后的頂葉皮質區域進行研究時發現，通過雙光子顯微鏡查看微血管，能夠在2000μm的深度下清晰成像，并且與活體成像中隨著深度增加信號迅速衰減不同，整體組織透明組織中的熒光信號強度在整個2000μm的工作距離內都能保持在表面信號強度的65%以上。因此，體外成像技術在深度和信號強度保持方面具有顯著優勢。

3、健康腦組織血管的量化分析
利用健康小鼠腦組織，研究團隊開發了一種用于量化血管系統的工作流程。通過對染色的血管進行計算建模，發現小腦不同區域（如顆粒層和分子層）的血管在數量、長度、表面積、直徑和體積等方面存在顯著差異。這一結果不僅證實了之前關于不同腦區血管差異的研究發現，也進一步強調了在研究細胞與腦微環境的空間關系時，選擇解剖學上明確且相同的區域進行比較的重要性。

4、腫瘤細胞與血管的關系剖析
★ 血管染色穩定性
為了探究腫瘤細胞是否影響血管內皮糖萼，研究人員通過原位異種移植人類細胞構建了腦部腫瘤模型。腫瘤生長并未顯著改變對腦微血管的染色模式，這意味著在腫瘤存在的情況下，仍可可靠地標記腦微血管。

★ GBM血管變化建模
運用iDISCO方法對固定不同時長的異種移植腦部腫瘤組織進行整體組織透明處理后，研究人員發現腫瘤核心區域的血管分支數量、總長度和表面積均有所增加，而平均血管直徑相較于對側相應區域略低，但最終導致腫瘤核心與對側區域的血管體積相當。這一變化反映了腫瘤微環境對血管系統的重塑作用，為深入理解腫瘤血管生成機制提供了重要依據。

★ GBM細胞分布特征
通過對GBM細胞在腫瘤核心、深部灰質和白質等不同解剖區域的分布進行量化分析，研究發現腫瘤核心區域的細胞密度顯著高于浸潤前沿區域。同時，計算腫瘤細胞與微血管之間的距離發現，在腫瘤核心區域，部分腫瘤細胞距離微血管較遠，而在深部灰質的浸潤前沿，腫瘤細胞更傾向于靠近微血管分布，這可能暗示了GBM細胞在深部灰質區域的遷移與血管密切相關，或者是腫瘤核心區域細胞增殖導致血管間距離增大。此外，研究還觀察到部分腫瘤細胞通過細胞突起相互連接形成類似多細胞網絡的結構，這一發現與之前的研究結果相符，進一步揭示了GBM細胞在腦內的復雜分布模式和相互作用方式。

研究結論
1、技術創新的價值
通過CLARITY和iDISCO等整體組織透明方法，研究人員能夠制備出透明的腦組織樣本，從而實現對腦微血管架構以及腫瘤細胞在腦部腫瘤微環境中分布的三維可視化研究。這種創新技術克服了傳統成像方法在深度和分辨率上的局限性，為深入研究腦部腫瘤微環境中的細胞與血管關系提供了有力工具。

2、揭示腫瘤細胞分布規律
研究結果詳細揭示了GBM細胞在腦內不同區域的分布差異，包括腫瘤核心與浸潤前沿、灰質與白質區域之間的細胞密度和與微血管距離的變化。這些發現有助于深入理解GBM細胞的遷移模式，如在灰質區域腫瘤細胞傾向于沿血管遷移，而在白質區域細胞遷移可能涉及多種途徑，包括沿著白質纖維束遷移等。此外，腫瘤細胞之間形成的網絡結構也為研究腫瘤細胞間通訊和集體行為提供了新的視角。

3、開辟研究新路徑
通過結合整體組織透明技術、熒光深層組織成像和3D空間定量統計分析方法，能夠更全面、精確地研究腦部腫瘤細胞與微環境之間的相互作用，這將有助于發現新的治療靶點和開發更有效的治療策略，為未來腦部腫瘤治療帶來新的希望。

展望未來
在抗體染色方面，雖然已注意到某些抗體需要優化，但未來還需更系統地探索不同抗體在大組織染色中的最佳條件，包括抗體濃度滴定、組織預處理方法等，以提高染色效果和特異性。此外，還可進一步探索其他具有特異性結合能力的分子探針，以實現對腦部腫瘤微環境中更多細胞類型和分子標記的可視化研究。

在未來研究中，應更加關注這些技術在臨床轉化方面的潛力，且腦部腫瘤研究涉及多個學科領域，如神經科學、腫瘤學、生物醫學工程和影像學等。未來需要進一步加強多學科之間的合作與融合，整合不同學科的理論和技術優勢。例如，結合神經科學對腦功能和神經回路的理解，以及生物醫學工程在新型成像設備和材料開發方面的創新，推動腦部腫瘤研究在基礎機制探索和臨床應用方面取得更大突破。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：Lagerweij, T., Dusoswa, S.A., Negrean, A. et al. Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment. Angiogenesis 20, 533–546 (2017). https://doi.org/10.1007/s10456-017-9565-6.