細胞培養基礎實驗入門指南

什么是細胞培養？
    細胞培養是指將細胞從動物或植物體內取出，然后在適宜的人工環境中生長的過程。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離，也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。
細胞培養的具體步驟可分為：細胞復蘇、細胞傳代、細胞凍存

• 準備工作

• 器皿與試劑準備：清洗、干燥并消毒所有需要的器皿，如培養皿、離心管、移液槍頭等。同時，配制好培養基、PBS緩沖液、胰蛋白酶等試劑，并進行滅菌處理。
• 無菌環境準備：確保超凈工作臺或生物安全柜已經過清潔與消毒，紫外線照射足夠時間以殺滅微生物。
• 預熱培養液：將配制好的培養基、PBS和胰蛋白酶等放入37℃水浴中預熱，以減少對細胞的溫度沖擊。

• 細胞復蘇

• 取出凍存細胞：從液氮罐中取出凍存管，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動以促進快速融化（約1-1.5min）。
• 細胞懸液制備：將融化的細胞懸液轉移到離心管中，加入適量的培養基稀釋并離心（如1000轉/min，5min），以去除凍存液中的DMSO等有害物質。
• 接種培養：倒掉上清液，用新鮮培養基重懸細胞，然后接種到培養皿或培養瓶中，放入含5% CO₂的37℃培養箱中進行培養。

• 細胞培養

• 換液：根據細胞生長情況定期更換新鮮培養基，通常生長穩定的細胞每2-3天換液一次，生長緩慢的細胞可3-4天換液一次。換液時，先吸去舊培養基，用PBS緩沖液清洗細胞表面，再加入新培養基。
• 觀察記錄：每天觀察細胞的生長狀態、形態變化以及培養液的顏色和透明度等，記錄細胞生長曲線和傳代時間等關鍵信息。

• 細胞傳代

• 細胞消化：當細胞覆蓋率達到80%-90%時，進行傳代操作。首先吸去舊培養基，用PBS緩沖液清洗細胞表面，然后加入適量的胰蛋白酶進行消化（消化時間根據細胞類型而定，一般為1-2min）。
• 終止消化：待細胞變圓并脫落時，加入等體積的含血清培養基終止胰蛋白酶的消化作用。
• 細胞計數與接種：將細胞懸液轉移到離心管中離心，倒掉上清液后用新鮮培養基重懸細胞，并進行細胞計數。根據實驗需要調整細胞密度后接種到新的培養皿或培養瓶中繼續培養。

• 細胞凍存

• 細胞收集：選擇生長狀態良好的細胞進行凍存。按照傳代步驟收集細胞懸液并離心去除上清液。
• 配制凍存液：通常使用70%完全培養基+20% FBS（胎牛血清）+10% DMSO的比例配制凍存液。注意DMSO要慢慢滴加并邊滴邊搖勻。
• 細胞凍存：將細胞重懸于凍存液中并分裝到滅菌的凍存管中，標明細胞種類、凍存日期等信息。然后按照4℃ 30min、-20℃ 30min、-80℃過夜的程序進行梯度降溫處理，最后轉移到液氮罐中長期保存。

六、注意事項

• 無菌操作：整個細胞培養過程中必須嚴格遵守無菌操作規程以防止微生物污染。
• 操作輕柔：在處理細胞時要輕柔操作以減少對細胞的機械損傷。
• 監控環境：定期檢測培養箱內的溫度、濕度和氣體成分等參數以確保細胞處于最佳生長環境。
• 及時記錄：詳細記錄每一步操作的時間、條件和結果以便后續分析和復現實驗。

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