共焦顯微鏡技術的技術原理、發展歷程及應用

共焦顯微測量是一種很有前景的技術，具有非接觸測量和高精度位移識別能力，廣泛應用在芯片加工、高精密儀器制造、生物醫學、材料化學、工業檢測等領域。

其沿軸向位置高精度掃描的二維圖像可用于三維重建，然而，掃描的速度限制了圖像的采集速率，為了克服這一局限性，研究人員提出了許多方法對傳統的共聚焦顯微鏡系統進行了改進。例如，基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡、基于數字微鏡裝置的共焦顯微鏡、差分式掃描共焦顯微鏡等。

上海理工大學的毛肖肖團隊發表文章討論了各種共聚焦顯微鏡的工作原理、物鏡類型、掃描方法、優缺點及應用。隨著光學核心部件的升級和各種準確、高效算法的出現，未來共焦顯微鏡的掃描速度會更快、應用范圍更廣、分辨率更高。

發展歷程與工作原理
1955年，Marvin制造出了第一臺共聚焦顯微鏡，為這一技術的發展奠定了基礎。1984年，Molesini等基于波長位移編碼原理構建了表面輪廓儀，進一步推動了共焦技術的發展。此后，彩色共焦技術不斷更新和擴展應用，眾多科研人員在這一領域不斷探索，使得共焦顯微鏡技術逐漸成熟。

1.激光共焦顯微鏡
激光共焦顯微鏡是在普通顯微鏡的基礎上引入了“共焦技術”和 “激光掃描技術”。它以激光束為光源，激光通過照明針孔和準直透鏡形成平行光，然后從分光鏡反射到物鏡并聚焦在樣品上，在焦平面中對樣品進行逐點X-Y軸掃描，探測器獲得二維圖像。由于光路中探測針孔和照明針孔存在共軛關系，只有聚焦在焦平面上的點才能在探測針孔處成像，焦平面外的點不會干擾成像。通過調整聚焦平面在Z軸上的位置，可獲得一系列光學切片圖像用于三維重建。

2.彩色共焦顯微鏡
彩色共焦系統采用復色光源，探測器通過接收不同波長的光信號還原出被測表面的三維形貌。復色光進入系統后，因色散物鏡的色散作用會聚焦在不同軸向位置，只有聚焦在焦平面上的光才能進入探測器，其余雜散光被針孔遮擋。通過改變焦平面位置，就能獲取樣品不同深度的表面信息。通常將共焦反射顯微鏡放置在焦平面處，利用三維位移控制器改變物體位置，用CCD采集一系列不同深度二維圖像，最后進行三維重建。

共焦顯微系統的組成
1.色散物鏡
色散物鏡是共焦系統的核心部件，其設計方式主要有折射式和衍射式。
折射式色散物鏡：光學系統設計成熟，加工簡單，價格合理，便于色散，早期應用廣泛。不同研究人員通過各種透鏡組合設計，實現了不同的色散和測量效果。例如，在不同波長范圍內實現了不同的色散值和軸向分辨率，以及不同的測量范圍和精度。

衍射式色散物鏡：其色散特性與傳統折射光學器件相反，色散效果更明顯。為提高系統性能，常將折射和衍射透鏡組合使用。此外，菲涅爾透鏡也具有獨特優勢，如更好的線性度、可折疊等，但在寬波段成像方面還需進一步探索。

2.光源
共焦顯微鏡的照明針孔和探測針孔具有共軛關系，這一特性實現了三維空間濾波，可獲得高空間分辨率的光學切片。針孔直徑對成像的亮度和分辨率有重要影響，需綜合考慮信噪比和光通量。在不同樣本的共焦成像光路系統中，還需考慮針孔尺寸的調節和光路對準問題。對于彩色共焦技術，光源的選擇尤為重要，白光光源可能會有能量損失影響信噪比，而超連續光譜光源雖能擴展量程但價格昂貴。

3.共焦針孔
共焦針孔的大小需謹慎選擇。如果針孔尺寸過大，系統橫向分辨率將與傳統光學顯微鏡相同，軸向精度降低；尺寸過小則會影響光的通過，導致光強度損失，降低測量精度。為了實現針孔的快速、準確以及可重復定位，開發了如圓形針孔電動線性陣列等多種改變針孔尺寸的系統。

共焦成像掃描方法
1.基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡
該系統使用激光作為點光源，通過兩個可控制轉動角度的轉向振鏡，分別對樣品進行X和Y方向的逐點掃描獲取二維圖像，最終實現三維重建。這種掃描方式避免了機械移動，提高了掃描速率，橫向分辨率是普通顯微鏡的2倍。但逐點掃描方式降低了測量效率，且探測器接收到的反射信號微弱，需使用靈敏度高的光電倍增管。

2.旋轉Nipkow圓盤掃描共焦
1884年德國科學家Nipkow等提出Nipkow轉盤法，1960年被應用在共焦顯微鏡中。利用旋轉Nipkow圓盤的掃描共焦是基于多光束掃描的方法，可以實時成像。光源發出的光穿過被測物體聚焦的共軛平面上的針孔，形成多個點光源照射在樣品表面，反射光在CCD上成像，配合圓盤高速旋轉實現快速二維成像。由區域檢測器獲取2D圖像，能形成真實共焦圖像，但轉盤對針孔尺寸和位置要求嚴格，不能改變系統分辨率，且系統復雜昂貴。

3.基于微透鏡陣列的共焦顯微鏡
基于微透鏡陣列的顯微成像可降低雜散光影響，提高三維圖像重構分辨率，還能提高光能利用率、擴大視場。其原理是將針孔陣列放置在分束鏡前，光源穿過針孔形成光源陣列照明物體表面，通過區域相機CCD捕捉反射的針孔圖案來確定高度，進而重建3D表面。但存在相鄰針孔串擾問題，隨著針孔間距減小，信噪比和深度分辨率降低，也會限制3D成像的橫向分辨率。

4.基于數字微鏡裝置的共焦顯微鏡
數字微鏡裝置（DMD）由微反射鏡組成陣列，可覆蓋具有數百萬個單獨控制像素的2D區域。將DMD用作光束調制器件，可獲得可編程針孔陣列，替代分束鏡。經過光束整型后的平行光通過DMD反射到色散透鏡，最后用CCD采集圖像信息。DMD可調整采樣點，控制掃描速率，但進行共焦測量時縱、橫向分辨率會比使用微透鏡陣列時下降。

5.差分式掃描共焦顯微鏡
20世紀90年代國外相關技術已成熟，其原理是從物體表面反射的光束被一分為二，分別聚焦到放置在焦前和焦后的兩個探測器上，對接收的軸向強度響應曲線進行差分計算獲取變化信息。這種方式通過檢測光學焦點改進了信噪比和軸向分辨率，抑制了噪聲，軸向分辨率雙倍提高，且不需要橫向掃描，可實現樣品表面輪廓的高速測量。

6.基于掃描源的彩色共焦顯微鏡
該顯微鏡采用波長掃描激光器連續、重復地產生與寬帶光源等效波長的光，經色散物鏡聚焦在被測物體上，由光電探測器接收發射光。系統不再使用光譜儀接收反射光，而是根據時間尺度反復獲得反射光的光譜信息，最終解碼光譜信息獲得物體表面信息。與常規CCM相比，可提高三維輪廓檢測速率。

共焦成像掃描方法
1.三維重建
在傳統共焦顯微鏡中，通過計算軸向響應的峰值強度確定物體軸向位置，常用的標準峰值波長提取算法存在誤差，研究人員提出了多種改進方法。在彩色共焦顯微鏡中，可將彩色相機替代光電探測器作為接收端，利用光學層析特性，通過記錄不同深度截面圖像重構物體完整圖像，需將RGB顏色模型轉換為合適模型并通過算法實現與波長的對應關系。

2.透明材料檢測
彩色共焦顯微鏡可對光學透明、半透明或弱散射材料進行斷層深度剖面、多層成像和缺陷檢查及厚度測量，檢測層間界面處反射光后可提供準確薄膜厚度信息，且不會損壞樣品。但測量過程中會因材料色散出現信號混疊、串擾等情況，降低信噪比，影響測量精度。需要對材料色散的誤差進行理論分析，建立補償模型提高測量精度。

3.工業集成檢測
在精密領域中，表面粗糙度是重要參數。彩色共焦法對被測物體表面的紋理、傾斜、顏色等外界因素不敏感，具有良好抗干擾性，精度高，易于集成，適合工業現場的表面粗糙度測量和在線檢測。例如，基于CCM開發的集成在微加工機床上的掃描系統，可在有振動環境下實現高精度測量，還可實現加工-測量一體化功能。

4.生物醫學成像
共焦顯微鏡在組織和細胞水平上對癌癥成像具有很大前景，熒光反射共焦顯微鏡是一種無創光學成像方法，可準確分辨組織并檢查皮膚細節，已被證明能高靈敏度和特異性診斷皮膚癌。還可結合其他生物技術用于多種生物醫學研究，如拍攝熒光圖像、全景掃描組織、觀察細胞代謝等。

5.其他應用
共焦顯微鏡的三維成像還應用于日常安全運輸中的變形監測、金屬厚度評估等領域。

總結與展望
傳統的共焦測量法曾受視野和實時測量局限，掃描速率和精度受限。隨著計算機和激光技術的快速發展，以及對光源選型和色散透鏡分辨能力的深入研究，出現了多點并行的掃描方式，提高了二維信息采集速度和三維成像速度。

彩色共焦法因省略軸向步驟等優勢，逐漸成為多個領域不可或缺的工具。相信在未來，共焦顯微鏡的掃描速度會更快、應用范圍更廣、分辨率更高，為微觀世界的探索提供更強大的支持。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于:毛肖肖, 趙斌, 董祥美, 高秀敏. 共焦顯微鏡技術及其應用[J]. 光學儀器, 2024, 46(1): 82. Xiaoxiao MAO, Bin ZHAO, Xiangmei DONG, Xiumin GAO. Confocal microscope technology and application[J]. Optical Instruments, 2024, 46(1): 82.​