小鼠原代小腸類器官培養實驗步驟及應用指南

#應用指南#

2009 年，Hans Clevers 及其團隊利用 Lgr5+ 腸干細胞在體外培養出了三維小腸類器官結構。這種結構反映了腸上皮細胞的生理狀況，可進行長期體外培養，同時保持細胞分化能力。這種方法越來越多地用于干細胞研究、疾病模型和再生醫學。

小腸類器官既可以用多能干細胞或胚胎干細胞培養，也可以用小腸隱窩干細胞培養。后者由于方便、技術簡單、可多次傳代，可進行長達兩個月的長期體外培養，因此更為常見。
 
本應用說明重點介紹了 GelNestTM 基質膠在小鼠腸道原代組織類器官培養中的應用。 Part.01 原代小腸組織提取消化
1. 將小鼠安樂死。從回腸末端采集 15 厘米長的腸管。
2. 去除外膜，用冷的 PBS 沖洗。用剪刀剪開腸段，使腸腔朝上。用冰凍 PBS 輕輕清洗剪開的腸段。
3. 在 50 mL 離心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀將腸管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 沖洗。重復清洗步驟，直至清澈為止。
4. 去除上清液，將組織碎片重懸于 25 mL 腸隱窩消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分鐘，然后在 20 rpm 旋轉床上旋轉 30 分鐘。去除上清液。
5. 將組織碎片重懸于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 緩沖溶液中。用 70 μm 過濾器過濾上清液，并將濾液裝入 50 mL 的干凈試管中。重復過濾 3 次，合并濾液。
6. 300×g 離心 5 分鐘。棄去上清液。
7. 將沉淀重懸于 10 mL PBS 緩沖溶液中。200×g 離心 3 分鐘。除去上清液。如果懸浮液中單細胞過多，請重復離心步驟。
 
Part.02 小腸隱窩計數篩選與接種
1. 取 10 μL 細胞樣本，在顯微鏡下計數隱窩。200×g 離心 3 分鐘，取出上清液。
注：適合培養的隱窩大小不一，通常呈長方形或圓形，邊緣相當光滑，看起來像上皮單層的小的折疊部分。絨毛、單細胞或碎屑濃度較高的部分不是類器官培養的理想選擇。目標是最大程度地富集合適的隱窩。
2. 將隱窩重懸在腸類器官完全培養基中，每微升培養基含 8-20 個隱窩。制作完全培養基時，加入：
3. 取 150 μL 隱窩懸浮液，與等體積未稀釋的 GelNestTM 類器官專用基質膠（NEST 211272）混合，然后輕輕地用移液管上下移動十次，使其充分混合。
4. 將 50 μL 樣品加入預熱好的 24 孔板的每個孔的中心，形成圓頂狀結構。避免形成氣泡。
5. 將平板置于 37℃，靜置 10 分鐘，使基質凝膠凝固。小心處理平板，避免干擾凝膠。
6. 小心地向每個孔中加入 500 μL 室溫（15-25℃）類器官培養基，從側面倒入以避免擾動凝膠。  
Part.03 類器官培養與觀察
1. 監測類器官的生長。通常，在培養 3 小時左右，隱窩形成球形結構。2-4 天后，類器官開始出芽，到第5-7 天形成復雜結構。
2. 第二天完全更換培養基。小心去除孔邊緣的舊培養基，加入 500 μL 新鮮的室溫類器官培養基。
3. 定期在倒置顯微鏡下觀察腸類器官并記錄。
4. 選擇合適的抗體對類器官進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察，同時包括適當的特異性對照。
5.使用NEST免費的類器官AI大模型分析軟件進行識別批量、無標記分析由顯微鏡獲取的類器官照片（不限顯微鏡品牌），幫助您更快、更準確的獲得類器官的數量、大小（面積）、圓度、周長、灰度值（可統計熒光照片的不同類器官/細胞球的熒光強度，或明場照片的類器官亮度，從而反應類器官的死活狀態）等參數，并生成統計分析結果。

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NEST聯手AI，發布類器官免費智能分析軟件 在第 2 天在 10 倍物鏡下，可觀察到小型空泡狀結構；在第 3 天可觀察到明顯變大的空泡結構；在第 6 天可觀察到具有多個出芽結構的小腸類器官，且培養皿里的類器官可肉眼直接觀察到白色顆粒狀細胞團。標尺為 200 微米。  
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中生長的早期的小腸類器官為單細胞層形成的空泡結構，并且將小腸類器官種在 100 倍稀釋的 GelNestTM 基質膠包被的平皿里，細胞仍然保持有較好的增殖能力（ki67 陽性）。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；alpha-Tubulin 為細胞骨架蛋白（紅色）；ki67 為表達于細胞核中的細胞增殖活性的標志物。標尺為 150 微米。  
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中（3D）或者在基質膠薄層上（2D）生長的小腸類器官均能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為 100微米。  
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中（3D）生長的小腸類器官能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為100 微米。