Celloger® Pro活細胞成像系統應用于脂肪生成的研究

    脂肪細胞作為重要的能量儲存庫，能有效地將多余的卡路里轉化為脂肪，以滿足機體的能量需求。然而，過多的脂肪積累會導致肥胖，這是現代社會中與各種健康問題相關的一種狀況^[1]。除了在新陳代謝中發揮作用外，脂肪細胞還通過利用瘦素和脂聯素等激素影響免疫反應和生殖功能^[2]。
脂肪形成的過程，即前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程，在不同物種之間是不同的。此外，體內組織和體外細胞中發生脂肪形成的細胞比例也不同^[3]。研究人員正在積極探索脂肪形成的相關因素以及這一復雜過程背后的復雜調控機制。  
    由Sylvia P. Poulos發表的一篇綜述中表明，細胞的分化率隨培養基成分的不同而不同。此外，與脂肪形成相關的轉錄因子的表達水平也隨著時間的推移而變化。因此，評估不同時間點的脂肪形成程度是至關重要的。使用全自動活細胞成像設備，如Celloger^® Pro，可以方便地監測和測量脂肪生成。  
    以下內容便詳細介紹了通過Celloger^® Pro來研究前脂肪細胞系3T3-L脂肪生成的方法。
 
設備實拍：
    脂肪細胞的分化過程受到多種因素的高度調控和影響，包括前脂肪細胞的環境和藥物干預^[4、5、6]。其中，誘導分化時的細胞融合度被認為是影響脂肪細胞形成效率和質量的關鍵參數^[7]。此外，藥物制劑如羅格列酮，一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)的強效激動劑，已被證明在調節脂肪形成中發揮重要作用^{[8、9、10、11、12]}。
    因此，為了評估細胞初始密度如何影響脂肪細胞的分化，我們以四種不同密度播種3T3-L1細胞。此外為了確定羅格列酮對分化過程的影響，將實驗分為兩組，一組是含有羅格列酮的DM，另一組是不含羅格列酮的DM(圖3)。
    本次研究以下圖為實驗流程圖，圖內詳細標注了各項處理因素以及處理時間點。  

• 確定細胞融合度

    以四種不同密度播種3T3-L1細胞。在接種的第三天，我們使用Celloger^® Pro獲取細胞圖像來驗證融合程度，該功能會在指定日期自動捕獲細胞圖像(圖4a)。然后使用Celloger分析軟件分析這些捕獲的圖像，以確定融合程度(圖4b)。  

• 觀察細胞形態變化

    在實驗過程中，我們使用配備4X或10X鏡頭的Celloger^® Pro每隔一小時捕獲細胞圖像，驗證脂肪形成過程中的細胞形態的變化。我們在引入含有羅格列酮的DM II后立即觀察到脂滴形成的時間。細胞主要進化成棕色脂肪樣細胞，有許多微小的脂滴。使用帶有10X鏡頭的Celloger^® Pro，我們可以清楚地識別直徑超過3 μm的脂滴為清晰的水滴狀圖形，無需進一步染色。 該Time-lapse顯示DM II和羅格列酮處理后1小時至36小時每間隔1小時拍攝的圖像 (使用10倍放大，裁剪圖像)
 

• 觀察脂滴形成與脂滴定量

    Oil Red O試劑常用于染色脂滴來評估脂肪細胞的分化水平，但該染色方法在生理條件下是不可行的，很難追蹤隨時間細胞發生的變化。因此，我們選擇了LipiDyeII，一種適用于活細胞的熒光染料。LipiDyeII不僅可以染色脂滴，還可以在活細胞中進行分析，使過程更加簡單。使用LipiDyeII染色可以觀察到，細胞逐漸形成脂滴，以綠色熒光為特征。同時，熒光信號與明場圖像中觀察到的包膜結構精確吻合(圖6)。即使脂滴在細胞結構中被遮蔽(圖6中箭頭所示)，或者在亮場中太小而無法區分(圖6中虛線圈所示)，它們也可以很容易地使用熒光識別。  
    我們通過測量熒光覆蓋率來量化分化率，熒光覆蓋率表示脂滴所占的比例(圖7)。由于分化不是均勻地發生在整個平板上，因此有必要檢查廣泛的區域進行綜合分析。然而，使用低倍率(如2X)不足以精確測量小脂滴。因此，通過Celloger^® Pro的拼接功能，我們可以在更寬的范圍內測量脂滴的比例，獲得更可靠的數據。
    圖8顯示了添加或不添加羅格列酮DM II后第13天(圖8a)和整個5天期間(從第8天到第13天)(圖8b)觀察分析到的結果。羅格列酮顯著提高了脂肪細胞的分化率，熒光區增強表明脂肪堆積增加。未使用羅格列酮的DM II細胞在120小時后的分化率僅為4.7%。相反，用羅格列酮培養DM II細胞，細胞分化迅速增加，在97小時內細胞分化率達到16.6%。但不同濃度的細胞分化程度差異不大。  
結論：
    脂肪形成是一個復雜的過程，受多種因子的表達水平調控。理解這些復雜的機制需要長時間的細致觀察。傳統方法是，研究人員通過在分化過程中的特定時間點評估特定標記物的表達水平。然而，Celloger^® Pro系統能夠對這些通路進行連續、長期的監測，徹底改變了費時費力的傳統監測方法。利用延時成像功能，研究人員可以在不受時間限制的情況下進行長時間的觀測，從而提高實驗效率。Celloger^® Pro的一個顯著特點是其拼接功能，保證既能清晰觀察脂滴的形成又能捕獲大范圍的圖像區域，以評估整體脂肪細胞分化。此外，通過對脂滴進行熒光染色，并利用Celloger^®的分析軟件測量熒光強度，研究人員可以量化分化程度，為觀察到的變化提供數值。Celloger^® Pro的應用為研究脂肪細胞分化的動態調控機制提供了新的研究方法，促進了我們對脂肪形成及其在代謝健康中的關鍵作用的理解。

參考文獻：
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