高質量熒光成像小技巧

 

 

熒光染色是個麻煩的工作流程，辛苦染色樣品就為了獲得一張好的熒光圖片，如果成像沒做好、圖片沒拍好，那真的是血虧、白忙活。為什么要用熒光成像？如何用熒光顯微鏡拍攝才能獲得高質量的熒光成像？今天我們就來給大家介紹一下。

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熒光成像：現代實驗室必不可少的技術

熒光染色工作流相對明場染色復雜，那為什么要用熒光成像呢？首先回歸基礎概念，熒光是一種光致發光現象，指某些物質（如熒光探針）在一定波長激發光的照射下，在短時間內發出比激發光波長更長、能量更低可見光的現象。
  熒光成像具有高靈敏度和高特異性的獨特優勢，熒光探針可以特定性標記細胞器等目標，非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動態過程的追蹤等等，廣泛應用于細胞生物學、神經生物學、植物學、微生物學、病理學、遺傳學等各領域，是現代實驗室標配的檢測方案、成像方案。
  熒光成像一般使用熒光顯微鏡進行，根據不同的實驗目標，需要選擇不同型態的熒光顯微鏡，比如切片類樣品或水質檢查等高倍觀察適合用正置熒光顯微鏡，培養皿、活細胞類樣品適合用倒置熒光顯微鏡，植物和模式生物等大樣品適合用體視熒光顯微鏡。

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熒光顯微鏡的兩個核心部件

熒光的產生包含激發和發射兩個過程，在熒光顯微鏡中具體體現為熒光光源和激發塊兩個關鍵部件，已經都整個在熒光臂（熒光模塊）中，沒有這兩個部件，熒光無從談起，這兩個部件不合適，熒光效果大打折扣。
（1）激發光源：主要包含以下兩個指標

• 光源光譜覆蓋發射光譜：熒光探針在特定波段范圍才能被激發，因此激發光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光探針的激發特征。
• 發射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發光以產生較強信號的發射熒光信號。
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（2）激發塊：用于形成特異性激發/發射的一組濾光片，一般包含以下三個

• 激發濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發樣本中特定熒光探針
• 發射濾光片EM：允許熒光探針發射的特定波段的光通過
• 二向分色鏡DM：反射激發波段的光，透過發射波段的光。
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成像“寧欠勿曝”是個坑，曝光盡量亮一點
 

看完上面的資料，大家應該都對熒光顯微鏡有更好的了解了，下面我們來講成像拍照部分。

現在的熒光成像拍照基本都是用熒光顯微鏡搭配顯微鏡數字相機進行的，但不少教學資料可能還停留在膠片時代，這些資料可能和數字相機不太對得上，典型的就是“寧可欠曝，也不要過曝”，簡稱“寧欠勿曝”。舉個例子，上圖是一張JPG格式的欠曝的斑馬魚熒光圖片，看起來有點費眼神。
  通過后期調整亮度，斑馬魚的信號是增強了，但背景的雜訊和噪點也增強了，看起來很不干凈，色彩也出現了斷層。

膠片相機擅長表現暗部，因此才有“寧欠勿曝”，而顯微鏡數字相機相反，不擅長表現暗部，如果圖片欠曝，那么有效信號就更可能跟背景噪聲混在一起，從而降低了圖片的信噪比，成像效果就會不理想。因此對于顯微鏡數字相機來說，樣品信號的曝光盡量亮一點會更好，這可以通過在明美顯微成像系統中增加曝光時間或增益實現。

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選擇合適的熒光光源和激發塊

提升信號亮度
 

上面我們介紹過，熒光顯微鏡有兩個核心部件，熒光光源和激發塊。要提升熒光亮度，除了調整相機的曝光時間和增益，還要選擇高光強的熒光光源和合適的濾光片組。熒光光源典型代表是高壓汞燈，它可以在特定波長提供非常高的光強，缺點是需要預熱，使用壽命較短，且在壽命用盡之前還會有亮度衰減問題，如果你的汞燈亮度不足，建議先看看ND濾鏡是不是調錯了，如果ND濾鏡沒錯，那可能就是壽命快到了，要換個燈泡或換掉整個熒光光源。

部分資料可能還將金屬鹵素燈列為熒光光源，雖然鹵素燈能覆蓋激發光譜，且使用壽命比汞燈更長，但用作熒光光源時光強是不足的，熒光信號弱，不適合用于數字成像。
  現在我們有比汞燈和鹵素燈都要好的熒光光源，LED熒光光源，比如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100和四通道光源MG-120. LED熒光光源能提供接近汞燈的激發光譜和光強，而且可以即開即用，亮度可以線性調整，省去了預熱、調ND濾鏡等一系列流程，使用更加方便，而且壽命還能達到汞燈等幾十倍甚至上百倍。
  激發塊用于形成特異性激發/發射光譜，如果激發塊的參數和熒光探針的參數不匹配，就會導致樣品熒光信號弱，需要切換到合適的激發塊解決。另外激發塊還有個通光效率的參數，一般原裝進口濾光片組的通光效率要比國產濾光片組好幾十個百分比，熒光信號顯著更強，背景更暗，信噪比更高，但對應地成本也會高很多，明美選用進口濾光片組裝熒光激發塊，在保障良好的激發效果前提下，有效降低了成本，并且除了BGUYR等常用波段，還有針對結核檢查的寶藍B2和針對熒光原位雜交FISH的藍綠雙通等特殊配置，大大提升了病理檢查等成像應用的效率。

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使用高靈敏度相機和色階/曲線

提升信噪比

  數字相機隨著增益值提升和曝光時間的增加，會有不同程度的背景噪聲和熱噪聲問題，使用MC50-S、MSX2等高靈敏度相機可以用更低的曝光時間實現理想的曝光，這不僅更方便拍攝未固定的樣品，還能帶來更高的信噪比，因此熒光成像一般推薦用高靈敏度相機。
  熒光成像通常多多少少會有背景熒光問題，使用熒光擋板遮擋明場聚光鏡，能減少落射熒光成像時的背景熒光，而在數字相機成像時，我們可以通過調整明美顯微成像系統的色階或者曲線設置，實時壓低或去除背景熒光信號，再拍照。比如色階處理中，我們通常把滑條左下的滑塊往右調，來去除背景熒光信號，然后將中間滑塊往左調，適當補償樣品信號，即可獲得高信噪比的成像。

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圖片格式用TIFF更保險
 

在一開始的例子中，我們特別強調了JPG格式，那是不是用其他格式會更好？還真的是。舉個例子，上圖是一張TIF格式的欠曝樣品圖。
  通過簡單后期處理，我們還是可以獲得一張能用的樣品圖。這是因為JPG文件格式會將暗部細節和高光細節等人眼不善于分辨的內容丟掉，來壓縮數據量，這里面可能就包含對我們有用的樣品細節，而TIF格式可以儲存未壓縮的原始數據，這些數據經過處理還是有機會用得上的，這也是論文圖片通常用TIF格式的原因。

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