THUNDER小課堂：腦神經發育
整個小鼠胚胎的圖像：（左）原始寬場成像結果和（右）應用Large Volume Computational Clearing（LVCC）后的成像結果。圖片來源：A. Popratiloff和Z. Motahari，美國喬治·華盛頓大學。
本文介紹了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）對小鼠胚胎快速、高對比度成像，實現了對軸突生長和腦神經發育的研究。許多在發育早期階段損害神經回路發育的遺傳性疾病被認為會對行為造成干擾。用小鼠模型研究早期神經發育的細胞變化、定義與人類疾病相似的行為及潛在發育機制，是非常困難的。而鑒別發育的神經元回路中三叉神經（其參與面部感覺和運動機能）軸突生長的早期分化，使得這些困難迎刃而解。
簡介
人們普遍認為，很多遺傳性疾病都通過損害神經回路發育的早期階段來對行為產生干擾[1]。事實證明，在模型動物中分辨早期神經發育中細胞的此類變化具有一定的難度。用與人類遺傳性疾病中臨床顯著缺陷相似的基因突變小鼠模型來定義行為、神經回路和潛在發育機制，是非常困難的[1]。檢測單個神經元初始分化中的變化難以實現。這些挑戰可通過確定發育的神經回路中三叉神經這一關鍵組分的軸突生長的早期分化來解決[1]。通過著眼于參與面部感覺及運動機能如哺乳、進食、咬、咀嚼和吞咽等的三叉神經（腦神經V），以及軸突生長和原生傳導通路，可以對使用組織學處理可能會缺失的三維環境進行研究[1]。本文介紹如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]對小鼠胚胎快速、高對比度成像，以幫助進行腦神經發育研究。
挑戰
如要以實用高效的方式對整個小鼠胚胎成像，快速、清晰的高對比度3D成像解決方案，對于重要細節展示和解析大有益處。相較于激光共聚焦成像，可在很短的時間內一次性采集到完整胚胎的成像結果。傳統寬場顯微成像速度快，檢測靈敏度高，但是對厚標本的成像，如小鼠胚胎，通常會由于非焦平面信號的影響，呈現模糊的成像結果，降低圖像對比度[2,3]。
方法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture對小鼠胚胎成像。使用抗βIII微管蛋白（Tuj1）抗體對胚胎的神經系統和腦神經進行染色。結合BABB透明化處理，即可對整個胚胎中的神經系統進行三維結構成像。圖1中的圖像使用數值孔徑（NA）0.75、工作距離700μm的20x多浸液物鏡采集。該圖像由32個視野拼接組成，成像深度為672 μm（337層切），采集了完整的胚胎結構。數據采集總時長為18分鐘。
結果
通過LVCC和Instant Computational Clearing（ICC）將寬場成像固有的非焦面模糊信號清除[2,3]。之后，再使用徠卡自適應式反卷積技術來增強三維特征結構的分辨率[4]。這種成像模式便于觀察胚胎的神經結構以及胚胎的整體布局中更有價值的神經元定位。
圖1：展示整個小鼠胚胎的俯視圖，顯示原始數據（A）與應用LVCC后（B）的差異。根據相對物鏡深度進行顏色標識的胚胎的角度視圖，其中最大深度為672 μm。C）應用LVCC后的腦部側視圖，顯示了沿Z軸方向的精密細節。圖片來源：Anastas Popratiloff博士和Zahra Motahari博士，喬治·華盛頓大學納米制造與成像中心（GWNIC），美國華盛頓特區。
結論
與傳統的寬場成像不同，THUNDER技術Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]在對小鼠胚胎中的腦神經發育成像時，顯著增強了圖像對比度，對精密細節有更好的解析。
References：
1.Z. Motahari, T.M. Maynard, A. Popratiloff, S.A. Moody, A.-S. LaMantia, Aberrant early growth of individual trigeminal sensory and motor axons in a series of mouse genetic models of 22q11.2 deletion syndrome, Human Molecular Genetics (2020) vol. 29, iss. 18, pp. 3081-3093, DOI: 10.1093/hmg/ddaa199.
2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
4.V. Kohli, J.M. Marr, O. Schlicker, L. Felts, The Power of Pairing Adaptive Deconvolution with Computational Clearing: Technical Brief, Science Lab (2021) Leica Microsystems.
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