外泌體多參數(shù)綜合表征定量分析在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性與速度提升的詳解
近日，英國(guó)Oxford Nanoimaging公司專為外泌體（Exosome）研究量身定制的多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案全新升級(jí)，升級(jí)后的試劑盒EV Profiler Kit V2可以超分辨率精度量化納米級(jí)小型、稀有和珍貴的外泌體樣品，幫助您全面關(guān)注外泌體族群?jiǎn)栴}。EV Profiler Kit V2試劑盒主要優(yōu)勢(shì)歸納如下：
01.精準(zhǔn)識(shí)別和確定外泌體尺寸
國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)發(fā)布的MISEV指南概述了蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)標(biāo)記物在共定位時(shí)的組合可以為單顆粒測(cè)量的標(biāo)記提供更大的EV特異性證據(jù)。EV Profiler V2試劑盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司專門(mén)開(kāi)發(fā)的一種基于凝集素、可標(biāo)記外泌體膜糖蛋白的染料，與針對(duì)常見(jiàn)四次跨膜蛋白標(biāo)志物（CD9、CD63和CD81）的經(jīng)驗(yàn)證的抗體一起，能精準(zhǔn)識(shí)別外泌體并確定外泌體群體的大小分布。
圖1. Pan-EV 染色標(biāo)記的HCT116細(xì)胞系來(lái)源的外泌體圖像
圖2.Pan-EV染色確定不同外泌體群體的大小
圖1顯示了用Pan-EV染色（黃色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品紅色）標(biāo)記的HCT116細(xì)胞系來(lái)源的外泌體。圖2顯示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信號(hào)（右）的兩種不同的外泌體群體。
02.在同一樣本上檢測(cè)外泌體物質(zhì)運(yùn)輸和表面生物標(biāo)志物
EV Profiler Kit V2試劑盒可以檢測(cè)和量化單個(gè)外泌體水平上的物質(zhì)運(yùn)輸以及表面生物標(biāo)志物。同一樣本中可檢測(cè)3個(gè)標(biāo)志物。
圖3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌體
HCT116來(lái)源的外泌體用488標(biāo)記的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白組合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。圖3顯示了任一或兩種標(biāo)記物陽(yáng)性的外泌體中四次跨膜蛋白的數(shù)量或Syntenin-1計(jì)數(shù)。
03.評(píng)估外泌體形態(tài)
單分子定位顯微鏡與適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記探針結(jié)合使用，有助于評(píng)估純化后外泌體群體和單個(gè)外泌體的完整性和形態(tài)。EV Profiler Kit V2試劑盒中的Pan-EV染色結(jié)合ONI公司獨(dú)特的CODI云平臺(tái)上基于聚類的分析模塊，可以報(bào)告外泌體的形態(tài)特征，如大小和形狀等。
04.群體→單個(gè)，對(duì)外泌體跨尺度特征化
每個(gè)EV Profiler Kit V2包含足夠的材料，其中的4通道分析芯片已針對(duì)外泌體捕獲進(jìn)行了充分地開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，可以分析12個(gè)外泌體樣本。您可以使用適當(dāng)?shù)牟东@方法從任何給定來(lái)源捕獲數(shù)百個(gè)外泌體，并對(duì)其進(jìn)行成像，將單個(gè)外泌體放大，還可以查看單個(gè)外泌體水平上的生物標(biāo)志物分布。
圖5. 外泌體群體及單個(gè)成像
借助Nanoimager和CODI平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)外泌體樣本的成像和視覺(jué)檢查。在數(shù)千個(gè)外泌體種檢查其中一個(gè)外泌體時(shí)，標(biāo)尺范圍從10µm到50 nm不等。圖5這些外泌體是用ONI的S4分子捕獲的HCT116來(lái)源的外泌體樣品成像，并用Pan-EV染色（黃色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品紅色）標(biāo)記。
05.快速獲得結(jié)果
EV Profiler V2試劑盒包含用于捕獲、固定和染色外泌體所有必要的試劑。然后借助Nanomimager獲得單分子定位數(shù)據(jù)和納米級(jí)分辨率圖像，通過(guò)CODI平臺(tái)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在幾個(gè)小時(shí)就可以得到對(duì)單個(gè)外泌體成像的結(jié)果。該工作流程適用于低至10µL的外泌體樣本量。
圖6. 單個(gè)外泌體成像工作流程
06.更大的樣品靈活性
EV Profiler V2試劑盒為外泌體捕獲提供了3種選擇：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕獲。ONI驗(yàn)證了針對(duì)四次跨膜蛋白的捕獲抗體：試劑盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗體。
（2）磷脂酰絲氨酸依賴性、蛋白質(zhì)非依賴性捕獲。專有的S4捕獲分子可以與蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)的方式結(jié)合外泌體，這對(duì)富含磷脂酰絲氨酸的外泌體十分有效。
（3）自定義基于目標(biāo)的捕獲。根據(jù)您的目標(biāo)蛋白來(lái)選擇相應(yīng)的抗體——它只需要被生物素化（樣本由Nicole Meisner Kober博士的實(shí)驗(yàn)室提供）。
圖7.EV Profiler V2試劑盒三種捕獲方式
在EV Profiler V2試劑盒中，包括標(biāo)準(zhǔn)四次跨膜蛋白標(biāo)記物（CD9、CD63和CD81）的抗體，其與Tetraspanin Trio使用的相同熒光團(tuán)組合，使得研究人員能夠在需要時(shí)使用兩個(gè)通道來(lái)獲得自己感興趣的生物標(biāo)志物。EV Profiler V2試劑盒是一個(gè)模塊化試劑盒，您可以將其中的抗體替換為與自己的目標(biāo)蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體。
07.外泌體分析和量化變得更簡(jiǎn)單
CODI云平臺(tái)內(nèi)專門(mén)構(gòu)建的分析工具，可以無(wú)縫處理單分子定位數(shù)據(jù)，獲得輸出匯總數(shù)據(jù)的文件，如每個(gè)樣本的生物標(biāo)志物陽(yáng)性率、外泌體尺寸分布、每個(gè)外泌體的生物標(biāo)志物密度（定位/聚類）、外泌體形態(tài)參數(shù)、從外泌體樣本導(dǎo)出高分辨率三色圖像等。
圖8.CODI云軟件上的單分子數(shù)據(jù)聚類
圖8顯示了使用EV Profiler Kit V2試劑盒，Nanoimager拍攝的圖片。CODI云平臺(tái)使用單分子數(shù)據(jù)的聚類，可以幫助評(píng)估外泌體形態(tài)學(xué)特征并確定不同生物標(biāo)志物的陽(yáng)性水平。
總的來(lái)說(shuō)，與第一代多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案相比，EV Profiler V2試劑盒在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性、速度方面都有著巨大的提升。如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
01.精準(zhǔn)識(shí)別和確定外泌體尺寸
國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)發(fā)布的MISEV指南概述了蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)標(biāo)記物在共定位時(shí)的組合可以為單顆粒測(cè)量的標(biāo)記提供更大的EV特異性證據(jù)。EV Profiler V2試劑盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司專門(mén)開(kāi)發(fā)的一種基于凝集素、可標(biāo)記外泌體膜糖蛋白的染料，與針對(duì)常見(jiàn)四次跨膜蛋白標(biāo)志物（CD9、CD63和CD81）的經(jīng)驗(yàn)證的抗體一起，能精準(zhǔn)識(shí)別外泌體并確定外泌體群體的大小分布。
圖1. Pan-EV 染色標(biāo)記的HCT116細(xì)胞系來(lái)源的外泌體圖像
圖2.Pan-EV染色確定不同外泌體群體的大小
圖1顯示了用Pan-EV染色（黃色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品紅色）標(biāo)記的HCT116細(xì)胞系來(lái)源的外泌體。圖2顯示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信號(hào)（右）的兩種不同的外泌體群體。
02.在同一樣本上檢測(cè)外泌體物質(zhì)運(yùn)輸和表面生物標(biāo)志物
EV Profiler Kit V2試劑盒可以檢測(cè)和量化單個(gè)外泌體水平上的物質(zhì)運(yùn)輸以及表面生物標(biāo)志物。同一樣本中可檢測(cè)3個(gè)標(biāo)志物。
圖3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌體HCT116來(lái)源的外泌體用488標(biāo)記的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白組合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。圖3顯示了任一或兩種標(biāo)記物陽(yáng)性的外泌體中四次跨膜蛋白的數(shù)量或Syntenin-1計(jì)數(shù)。
03.評(píng)估外泌體形態(tài)
單分子定位顯微鏡與適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記探針結(jié)合使用，有助于評(píng)估純化后外泌體群體和單個(gè)外泌體的完整性和形態(tài)。EV Profiler Kit V2試劑盒中的Pan-EV染色結(jié)合ONI公司獨(dú)特的CODI云平臺(tái)上基于聚類的分析模塊，可以報(bào)告外泌體的形態(tài)特征，如大小和形狀等。
圖4.CODI分析模塊顯示外泌體的大小和形狀
圖4顯示了兩個(gè)疊加圖像的示例，其中A表示較小且較不圓的外泌體，B表示較大且較圓的外泌體。
04.群體→單個(gè)，對(duì)外泌體跨尺度特征化
每個(gè)EV Profiler Kit V2包含足夠的材料，其中的4通道分析芯片已針對(duì)外泌體捕獲進(jìn)行了充分地開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，可以分析12個(gè)外泌體樣本。您可以使用適當(dāng)?shù)牟东@方法從任何給定來(lái)源捕獲數(shù)百個(gè)外泌體，并對(duì)其進(jìn)行成像，將單個(gè)外泌體放大，還可以查看單個(gè)外泌體水平上的生物標(biāo)志物分布。
圖5. 外泌體群體及單個(gè)成像
借助Nanoimager和CODI平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)外泌體樣本的成像和視覺(jué)檢查。在數(shù)千個(gè)外泌體種檢查其中一個(gè)外泌體時(shí)，標(biāo)尺范圍從10µm到50 nm不等。圖5這些外泌體是用ONI的S4分子捕獲的HCT116來(lái)源的外泌體樣品成像，并用Pan-EV染色（黃色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品紅色）標(biāo)記。
05.快速獲得結(jié)果
EV Profiler V2試劑盒包含用于捕獲、固定和染色外泌體所有必要的試劑。然后借助Nanomimager獲得單分子定位數(shù)據(jù)和納米級(jí)分辨率圖像，通過(guò)CODI平臺(tái)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在幾個(gè)小時(shí)就可以得到對(duì)單個(gè)外泌體成像的結(jié)果。該工作流程適用于低至10µL的外泌體樣本量。
圖6. 單個(gè)外泌體成像工作流程
06.更大的樣品靈活性
EV Profiler V2試劑盒為外泌體捕獲提供了3種選擇：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕獲。ONI驗(yàn)證了針對(duì)四次跨膜蛋白的捕獲抗體：試劑盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗體。
（2）磷脂酰絲氨酸依賴性、蛋白質(zhì)非依賴性捕獲。專有的S4捕獲分子可以與蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)的方式結(jié)合外泌體，這對(duì)富含磷脂酰絲氨酸的外泌體十分有效。
（3）自定義基于目標(biāo)的捕獲。根據(jù)您的目標(biāo)蛋白來(lái)選擇相應(yīng)的抗體——它只需要被生物素化（樣本由Nicole Meisner Kober博士的實(shí)驗(yàn)室提供）。
圖7.EV Profiler V2試劑盒三種捕獲方式
在EV Profiler V2試劑盒中，包括標(biāo)準(zhǔn)四次跨膜蛋白標(biāo)記物（CD9、CD63和CD81）的抗體，其與Tetraspanin Trio使用的相同熒光團(tuán)組合，使得研究人員能夠在需要時(shí)使用兩個(gè)通道來(lái)獲得自己感興趣的生物標(biāo)志物。EV Profiler V2試劑盒是一個(gè)模塊化試劑盒，您可以將其中的抗體替換為與自己的目標(biāo)蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體。
07.外泌體分析和量化變得更簡(jiǎn)單
CODI云平臺(tái)內(nèi)專門(mén)構(gòu)建的分析工具，可以無(wú)縫處理單分子定位數(shù)據(jù)，獲得輸出匯總數(shù)據(jù)的文件，如每個(gè)樣本的生物標(biāo)志物陽(yáng)性率、外泌體尺寸分布、每個(gè)外泌體的生物標(biāo)志物密度（定位/聚類）、外泌體形態(tài)參數(shù)、從外泌體樣本導(dǎo)出高分辨率三色圖像等。
圖8.CODI云軟件上的單分子數(shù)據(jù)聚類
圖8顯示了使用EV Profiler Kit V2試劑盒，Nanoimager拍攝的圖片。CODI云平臺(tái)使用單分子數(shù)據(jù)的聚類，可以幫助評(píng)估外泌體形態(tài)學(xué)特征并確定不同生物標(biāo)志物的陽(yáng)性水平。
總的來(lái)說(shuō)，與第一代多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案相比，EV Profiler V2試劑盒在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性、速度方面都有著巨大的提升。如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
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