外泌體表征技術2022年JEV期刊論文盤點

    外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，是細胞間信號傳輸的載體。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續攀升，在2019年國家自然科學基金獲批項目中，外泌體研究相關項目的總數突破500個，立項的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規的光學顯微鏡無法對其進行成像分析，因此很少有技術能夠對單個外泌體進行物理表征和蛋白分型。

    美國NanoView Biosciences公司推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView系統，采用了SPIRS成像技術，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計數、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，目前在全球已近100多個實驗室采用該技術，發表文獻超過150篇。進入2022年，使用ExoView發表的論文出現井噴性增長，短短數月已經發表了近50篇。本文選取了三篇在高水平期刊《Journal of   Extracellular Vesicle》（JEV）發表的比較有代表性的文章，來說明ExoView在血樣本、光誘導、心功能不全等研究領域的具體應用。

四跨膜蛋白區分人血清和血漿中不同外泌體亞群-血漿中血小板外泌體的貢獻

    早期研究證明從血液中分離外泌體的能力對于將外泌體開發為疾病的生物標志物至關重要，尤其是從血漿和血清中分離外泌體，但很少有研究系統地比較這些來源的外泌體類型。Nasibeh Karimi等^[1]對確定血漿和血清中不同外泌體亞群的存在進行了研究。研究人員采集健康受試者血液，分別用   K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血漿，同時用血清凝塊激活劑管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和質譜等技術分析分離出的外泌體亞群。結果表明人類血液中含有多個攜帶不同四跨膜蛋白的外泌體亞群，使用不同的抗凝劑和離心方法，會影響外泌體亞群的分析。

    其中，研究人員使用ExoView對從血漿（EDTA）、血清以及人肥大細胞系分離的外泌體進行檢測，結果顯示在血漿和血清的樣本中，血小板蛋白CD41a抗體捕獲較多的是CD9+外泌體。與血清相比，血漿中的CD9+外泌體更多，并且是從血小板釋放的（圖1 a,b,c），然而血清中的CD63+/CD41a+外泌體的數量高于血漿（EDTA）（圖1 m,n），這與之前的磁珠ELISA法的結果保持一致。另外，在血漿、血清樣本中，被CD81抗體捕獲的外泌體的CD63+比例較低，而CD9+比例較高（圖1 a,b,d,e,g,h），進一步驗證了早先的研究結果，但是在人類肥大細胞系的樣本中，研究人員沒有觀察到這種差異（圖1 c,f,i,l）。另一方面，粒徑分析的結果顯示CD41a和CD9抗體捕獲的外泌體的粒徑相對較小，表明捕獲的外泌體是單外泌體，而不是外泌體聚合物（圖1 o）。
 

圖1 ExoView檢測從血漿、血清、人肥大細胞系分離的外泌體的數量、共定位和粒徑

光誘導免疫功能外泌體的高效產生

    基于外泌體的治療方法和疫苗正在不斷興起，然而基于臨床應用劑量規模的研發始終是一個巨大的瓶頸。為了克服這樣的障礙，Shaobo Ruan^[2]等開發了一種簡單直接的方法，通過利用近紫外LED燈（365 nm）的光感應來促進樹突狀細胞分泌外泌體 (DEV)。體外和體內實驗的結果顯示，近紫外波長不會損害細胞生長，使DEV生產率提高了13倍以上，同時讓DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成為理想的治療平臺。

    其中，研究人員使用ExoView對DEV的免疫性標記物進行檢測，把樣品組分為未處理的成熟樹突狀細胞來源的外泌體（mDEVs）、未處理的未成熟樹突狀細胞來源的外泌體（imDEVs）、近紫外光照射的成熟樹突狀細胞來源的外泌體（UV-mDEVs）、近紫外光照射的未成熟樹突狀細胞來源的外泌體（UV-imDEVs）。結果顯示在所有的分組中，CD9抗體捕獲的外泌體數量始終比CD81抗體捕獲高4倍多，這表明大多數DEV具有CD9表達，但可能不具有CD81表達（圖2 b,c,d)。CD63是外泌體中常見的結構和功能蛋白，這使得CD63+外泌體數量遠高于MHC-I+、MHC-II+、CD86+。以CD63作為內部參考，研究人員進行了兩次平行實驗以評估MHC-I/MHC-II與CD86的表達水平(圖2 c,d)。使用歸一化方法計算總捕獲DEV的生物標記物的相對百分比，結果表明mDEVs的MHC-I、MHC-II和CD86表達略高于imDEVs的表達（圖2 g,h）。該結果與早先研究結果一致，即mDEVs具有更強的免疫反應誘導性。此外，CD63/MHC-I/CD86、CD63/MHC-II/CD86、MHC-I/CD86、MHC-II/CD86或CD63/CD86的共表達在不同的 DEV條件下以及有或沒有進行光處理沒有明顯變化，盡管單獨的MHC-I或MHC-II在光處理后表現出輕微的減少（圖2 e,f），這證明光誘導對DEV的免疫標記表達幾乎沒有影響。在 DEV上保留必要的免疫標志物對于免疫反應至關重要。

圖2 ExoView檢測mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性標記物的數量、共定位以及進行熒光成像

含miR-421的外泌體與空氣污染（PM2.5）誘導心功能不全的發生機制相關

    大氣細顆粒物（PM2.5，空氣動力學直徑≤2.5μm）是空氣污染的主要原因。越來越多的證據表明，大氣PM2.5濃度的升高與總死亡率呈正相關，尤其是心血管疾病和呼吸系統疾病的死亡率。 PM2.5急性/亞急性暴露對人體的危害不容忽視，但是對于呼吸系統亞急性暴露于PM2.5所誘發心臟功能不全的分子機制尚不明確。上海大學王紅云[3]等在大氣污染相關的心血管疾病研究方面取得新進展，揭示了大氣PM2.5亞急性暴露引發心功能不全的新的分子機制：大氣PM2.5亞急性暴露在肺損傷后促進外泌體釋放其攜帶的miR-421，通過抑制ACE2導致 PM2.5誘導的心功能不全。

    其中，研究人員使用ExoView對從暴露于PM2.5的細胞上清液提取的外泌體以及對照組進行檢測。結果顯示，與對照組相比，PM2.5組的外泌體數量顯著比對照組多（圖3 a）。另外，粒徑的結果顯示了兩組外泌體的粒徑大小接近（圖3 d）。多色熒光成像圖表明，與對照組相比，PM2.5暴露增加了 CD63/CD81/CD9 共定位外泌體的數量（圖     3 c）。這些數據證明了PM2.5 暴露可顯著增加CD63+、CD81+和CD9 +外泌體。

圖3 ExoView檢測從暴露于PM2.5的細胞上清液提取的外泌體和對照組外泌體的計數、粒徑以及進行熒光成像

    在上述三篇文章中，科學家借助美國NanoView Biosciences公司研發的全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結果直接輸出外泌體粒徑，數目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。三篇文章分別從血樣本、光誘導、心功能不全等研究領域介紹了ExoView的無需純化，全面表征的特點，有力地證明ExoView是外泌體檢測的一大利器。

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☛ 上海大學在《Journal of extracellular vesicles》發表文章。

☛ 中國科學院深圳技術研究院在《Lab on a Chip》發表文章。

☛  北京天壇醫院、國家納米科學中心、北京航空航天大學在《Advanced Science》發表文章。

☛  同濟大學附屬上海市肺科醫院、上海思路迪轉化醫學在《Journal of Nanobiotechnology》發表文章。

☛ 山東千佛山醫院在《NANO LETTERS》發表文章 

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參考文獻：

[1] Nasibeh Karimi, Razieh Dalirfardouei,   Tomás Dias, Jan Lötvall, Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma –  Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

[2] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles.  Journal of extracellular vesicles,   https://doi.org/10.1002/jev2.12194.

[3] Hongyun Wang, Tianhui Wang, Wei Rui, Jinxin Xie, Yuling Xie, Xiao Zhang, Longfei Guan, Guoping Li, Zhiyong Lei, Raymond M Schiffelers, Joost P G Sluijter, Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppress air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signaling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.

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