超分辨率顯微技術在研究細胞結構中的應用和原理

STORM的數(shù)字圖像處理系統(tǒng)
 

“數(shù)字圖像處理是通過圖像數(shù)據進行相關功能處理和分析的技術。在storm（stochastic optical reconstruction microscopy）系統(tǒng)中，生物樣本信息經由光路放大后，投射到系統(tǒng)的主相機感光板上，轉化為數(shù)字圖像數(shù)據，由數(shù)字圖像處理系統(tǒng)統(tǒng)一進行處理。本文就storm的數(shù)字圖像處理系統(tǒng)給大家做個介紹。”

由于光學衍射極限的存在，對于200納米以下的顯微樣品結構，就無法利用光學放大的方式去進行觀測，舉個例子，圖1（a）和圖1（b）是兩個在數(shù)字圖像中坐標位置不同的光斑，將兩個光斑進行疊加，獲得圖1（c）的重合光斑。由此可知，圖1（c）是由圖1（a）和圖1（b）兩個結構結合而成的，但由于衍射極限的存在，我們無法將圖1（c）進行放大，從而獲得前者的兩個結構特征，這就是storm系統(tǒng)中數(shù)字圖像處理系統(tǒng)要解決的實際問題：如何通過有效的圖像數(shù)據，獲得200納米衍射極限下的樣本結構信息。 “無論一個樣品結構有多復雜，總是能夠描述為是由一個個點構成的。”這就是storm的核心原理，如圖2所示，假設圖1中的兩個光斑結構在不同時間分別進行閃爍，對閃爍的每一幀圖像數(shù)據中的高斯光斑進行捕捉和擬合，獲得高斯光斑的中心位置并記錄，在完成拍攝后，將所有記錄下的光斑信息進行疊加重構，便可獲得完整的結構信息。
在storm系統(tǒng)中，通過生物試劑以及光學激發(fā)，利用計算機處理相機拍攝到的隨機熒光閃爍，并對閃爍的光斑進行統(tǒng)一分析，就可獲得生物樣本200納米以下的結構信息，如圖3為數(shù)字圖像處理系統(tǒng)處理后得到的細胞內部結構圖。 1、串色

串擾問題可以定義為熒光從一個通道到其他通道的泄漏，串擾的原因是因為多種熒光染料的發(fā)射光譜重疊。然而，二向色鏡無法完全阻擋重疊光譜，這就導致當前通道上會出現(xiàn)不屬于該通道的圖像信息。
要解決串擾問題，首先要確定串擾的比例，拍攝單一染料的寬視場圖像，然后得到每個樣品中每個通道的平均強度，以形成包含所有九個平均強度的強度矩陣，通過圖像系統(tǒng)中的串色抑制算法，便可在原始圖像數(shù)據上做抑制，通過圖像數(shù)據計算的方式解決串色問題。

2、通道對齊

storm系統(tǒng)支持多通道同時成像，在硬件結構上，光路結構的差異和色差造成各個通道之間存在一定的誤差。

如圖6所示，紅通道(561nm激光)與綠通道（647nm激光）在拍攝金納米粒子時產生的圖像分離。
經實驗發(fā)現(xiàn)，由于光路傳遞的原因，會造成每個通道會產生不同的程度的畸變與距離偏差，為了抵消這些系統(tǒng)誤差，數(shù)字圖像系統(tǒng)利用金納米粒子對系統(tǒng)誤差進行修正，在拍攝好金納米粒子的寬場圖像后，對每個熒光點在x與y方向進行通道誤差計算，獲得每個金納米點與對應通道上的最近鄰匹配點的誤差數(shù)據，通過對齊算法，最終確定當前通道與對應通道之間的誤差關系。

3、3D校準

storm不僅可以拍攝生物樣本的二維信息，還可以對生物樣本的三維信息進行分析與重構，這時就需要對三維方向上的誤差進行校準，以便展示給用戶的是最準確的信息。

三維信息獲取的一種方式是依靠系統(tǒng)光路中的柱面鏡對成像造成的影響，如圖6所示在加入柱面鏡后，當發(fā)光點位于焦平面下方時，捕獲到的光斑為豎直方向拉伸，同理，當發(fā)光點位于焦平面上方時，捕獲到的光斑為橫方向拉伸。利用這個特性，通過對光斑形態(tài)的分析，便可獲得每個光斑在超高亞像素上的長寬邊界差值與深度信息的曲線關系，從而反向推導出該發(fā)光點的實際深度信息。
在獲得每個閃爍光斑的深度信息后，storm便可對拍攝樣本進行3D重構，獲得如下效果： 超分辨率顯微作為一類很新的技術，突破了光學成像中的衍射極限，把傳統(tǒng)成像分辨率提高了10～20倍，成為研究細胞結構的利器。過去七八年間，這些技術不斷推進，先后實現(xiàn)了多色、三維和活細胞高速成像，這些技術的發(fā)展都離不開數(shù)字圖像處理技術的功勞。科技的進步，有賴于站在巨人的肩膀上，將各個不同領域的技術和智慧有機結合，這便是storm的魅力所在。

參考文獻

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[3] Yu, Lujia. Three color super-resolution localization microscopy for optical mapping of stretched DNAs in nanochannels.Thesis (M.Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2019