冷凍斷裂與冷凍蝕刻基礎介紹

圖1：麥葉上的蚜蟲
 

適合于電子顯微鏡的環境

電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降至極低壓力。置于這種環境下的活細胞無法有效保全結構，因為細胞構成中的大部分水分會快速蒸發。

生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存，這樣后續脫水對原位結構的破壞最小，同時可以使用環境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態下含水結構的唯一方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變為六邊形冰時體積會增加）而是無定形冰，因此體積保持不變。所以，對滲透和溫度變化敏感的結構得以保留（見文章“高壓冷凍基礎介紹”）。

要觀察諸如細胞器、細胞膜、乳膠或液體的表面界面等結構，冷凍斷裂是唯一的方法。通過刀片（或類似物）或釋放彈簧負載的外力來破開冷凍樣本，并沿著最小阻力線斷裂樣本。

圖2：冷凍斷裂（來源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity）
 

水的升華與凝結 – 冷凍蝕刻與污染

要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結構。升華的過程是冰不經過液態過程直接轉化為氣態。而液態過程會導致樣品體積和結構的破壞。

圖3：ES，細胞外表面；PF，細胞膜冷凍斷裂面；EF，細胞膜外層冷凍斷裂面；FS，細胞膜內表面；Cyt，細胞質
 

水的升華/冷凝過程取決于特定溫度下的飽和壓力，以及水或冰在室內的有效水分壓。

注意：良好的真空度會降低水分壓。

例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內達到這個壓力，則冷凝和蒸發處于平衡狀態。蒸發的分子數量等于冷凝的分子數量。在更高壓力下，冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會在樣本表面上生長。必須采取一切手段來避免這種情況。樣本上方一個較冷（比樣本更冷）的冷阱會降低局部壓力，從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優先附著在較冷的表面上。在低于飽和壓力的壓力下，更多的分子升華而不是冷凝，同時會發生冷凍蝕刻。

執行冷凍蝕刻直到樣本完全無冰，這一過程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時間內執行的小樣本。該過程分為幾個步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃，同時在每個步驟上使溫度保持一定時間。該過程需要幾天的時間來完成。

圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）
 

• 樣本深處的水升華速度比表面的水更慢。
• 鹽和大分子溶劑會降低升華速度。
• 生物樣本中大量存在的結合水會降低升華速度。