平鋪光片顯微鏡如何實現均一高分辨率成像

隨著組織透明化技術和光片熒光顯微技術的發展，3D熒光成像技術實現了快速獲取3D組織信息的能力。光片顯微鏡由于其獨特的3D成像能力以及更快的成像速度逐漸成為生命科學研究中3D熒光成像的強有力工具。光片顯微鏡的實現方式是將激發光片限制在探測焦平面內，使得激發光對樣品的光漂白和光毒性降到最低，具有高的三維空間分辨率和良好的光學層析能力。

在光片顯微鏡中，光片越薄，光片層析能力越好，軸向分辨率越高；光片越厚，光學層析能力減弱，軸向分辨率變差。由于高斯光束的截面半徑連線為雙曲線，光片在沿著光傳播的方向上無法一直保持厚度一致，光片較薄也就是軸向分辨率最好的一段被稱為束腰。通常，我們以光片束腰的長度作為選擇視野大小的依據。束腰的長度與光片的厚度是正相關的，要想獲得更高的軸向分辨率，光片就需要更薄，束腰就會越短，相應的視場就越小；同理，想要獲取更大的視場，光片就越厚，束腰更長，相應的光學層析能力減弱、軸向分辨率降低。那么如何制作一個薄且均勻的激發光片來覆蓋大的FOV（Field of view），并盡可能將激發光限制在探測焦平面附近呢？

為尋求空間分辨率、光學層析能力和FOV之間的最佳平衡，最大限度地發揮光片熒光顯微鏡的3D成像能力，西湖大學高亮實驗室提出了平鋪光片技術的概念，旨在滿足兩個要求：首先，顯微鏡可以實現最新的選擇性照明光片，以便在不同的應用中發揮其優勢，并且可以快速調整光片以實時優化成像性能；其次，可以在檢測圖像平面內快速平鋪光片以擴大視野且不影響空間分辨率和光學層析能力。基于平鋪光片技術，高亮實驗室與锘海生命科學共同研制了新型平鋪光片照明顯微鏡LS18。

傳統光片顯微鏡的成像方式是怎么樣的？

光片顯微鏡對一個大的樣品組織進行三維成像時需要將樣本細分成多個ROI（Region of interest）成像。這種方式本質上是光片顯微鏡中空間分辨率和視場大小之間的折衷。

如圖1所示，在較大的FOV下，采用一個較長的光片激發成像，該方式成像的特點在于它的成像速度快，采集圖像的數據量小，且整個樣品被劃分的ROI較少，圖像三維重構相對容易。然而，由于此時用的放大倍數較小，視野大的同時，光片也較厚，因此光片的層析能力也大幅度降低，成像結果不但在橫向上的分辨率較低，其軸向上的分辨率也更低。

圖1 大的FOV下，傳統光片顯微鏡成像模式

這時，研究者若想獲取更高空間分辨率的3D成像數據，就需要使用更大的放大倍數并且采用更薄的光片。那么，成像的FOV縮小，樣本成像細分的ROI將增多（如圖2所示），導致樣品在橫向上的平移次數增加，此時采用的光片更薄，使得軸向上步進減小，樣品成像的速度變慢。樣品成像時間及采集數據大小會隨著空間分辨率的增高而增加。此時圖像重建工作量也將大幅度增大，主要原因有： 1. 采集數據大小明顯增大；2. 需要在ROI之間做更多的圖像拼合處理；3. 一些透明化方法處理的樣品較軟，且成像液的粘度較高，頻繁移動可能使樣品在成像過程中產生形變，給數據拼合增加困難。因此，樣品在橫向上的平移速度必須足夠慢，以盡量減少3D重建的問題，這就進一步降低了樣品成像速度。

 圖2 高分辨率下，傳統光片顯微鏡的成像方式

什么是平鋪光片技術？

平鋪光片技術是一種新型的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）三維成像技術，在不增加光片厚度、不降低激發光片約束能力的情況下，增加SPIM的FOV。如圖3所示，在探測焦平面內沿光片長軸方向(y方向)平鋪小而薄的光片，在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合并重建整個FOV的圖像。

圖3. TLS-SPIM的工作原理，（左）通過快速平鋪小而薄的光片，（右）在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合重建整個FOV的圖像。

LS18是如何實現快速高分辨3D成像的？

LS18光片顯微鏡采用平鋪光片技術，通過對空間光調制器加載不同的相位圖對激發光束進行調制，實現快速平鋪短而薄的光片，擴大了FOV且不影響空間分辨率和光學層析能力，從而獲得均一的高分辨率3D圖像。而空間光調制器對激發光相位進行調制幾乎可以解決所有的光片校準問題，真正地實現顯微鏡儀器的自動校準，并且性能非常穩定。另外，根據不同樣品的研究需求，LS18光片顯微鏡能夠靈活地調整光片平鋪次數以及成像速度，實現不同類型的完整組織器官的3D精準結構與功能測量。
 

如圖4所示，相同的樣本，平鋪光片顯微鏡在較大的FOV下，快速平鋪小而薄的光片，達到視野內成像分辨率均一，在不增加樣本平移和圖像重建問題的前提下，可以獲得更高的空間分辨率、更好的光學層析能力和更快的成像速度。此外，平鋪光片顯微鏡采用長工作距離、高數值孔徑物鏡和高分辨率檢測相機，使得單個ROI視野盡可能大，并保持橫向空間分辨率，從而盡可能地發揮使用平鋪光片的優勢。

圖4 高的空間分辨率下，平鋪光片顯微鏡的成像模式

參考文獻：

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3、Chen Y , Li X , ZhangD , et al. A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Cleared TissuesImaging[J]. bioRxiv 829267, 2020

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