組織透明化與锘海LS18在阿爾茲海默病研究中的應用

每年的9月21日是“世界阿爾茨海默病日”。目前，全世界約有4000萬癡呆癥患者，其中大部分為阿爾茲海默病（Alzheimer’s Disease, 簡稱為AD）患者。我國約有1000萬AD患者，存在高患病率、低知曉率、低診斷率和低治療率的“一高三低”狀況。

細胞外β淀粉樣蛋白沉積和細胞內tau蛋白磷酸化是AD的主要病理特征，異常的神經活動可以加劇AD的病理發展并最終破壞與高等認知功能相關的神經環路。反之，通過調控一些神經活動也被證實可以減緩AD病情。2019年，來自麻省理工學院的Martorell等人在《細胞》雜志刊登的文章中【1】，使用伽馬共振感官刺激（gamma entrainment usingsensory stimuli， 簡稱為GENUS）對5XFAD阿爾茲海默病模型小鼠進行干預。他們發現，聽覺GENUS使用音頻誘導小鼠聽覺皮層（AC）和海馬CA1區產生伽馬頻率的神經活動可以促進空間和認知記憶，并減輕相應區域的淀粉樣蛋白沉積。聽覺GENUS還引起相應區域的小膠質細胞活化和血管擴張反應，并在Tau P301S小鼠模型中減少了Tau蛋白磷酸化。而同時使用40Hz的視覺+聽覺GENUS（不能只是二者之一）更進一步地使腹內側前額葉皮層產生膠質細胞反應。為了更廣泛地探尋GENUS對于模型小鼠產生的作用，文章作者采用SHIELD方法對小鼠整腦厚切片進行了透明化處理，通過三維光片熒光顯微整腦成像和數據分析揭示出為期一周的視覺+聽覺GENUS讓小鼠整個新皮質中的淀粉樣蛋白負荷體積減少了37%，數量減少了34%（圖一）。GENUS這種無創性的干預方法在病理和行為兩方面緩解了AD模式動物的癥狀，是否能運用于人類還有待進一步證實。

圖一：經過SHIELD透明化處理的6月齡5XFAD小鼠整腦25um矢狀面厚切片（G為無干預對照，H為視覺+聽覺GENUS干預），使用anti-Aβ plaques抗體免疫染色。

SHIELD透明化技術及光片熒光顯微成像技術簡介

神經系統是結構與功能最復雜的人體系統，成百上千種不同類型的細胞形成繁復的神經回路與網絡，讓人們難以從二維切片獲取足夠的信息來進行研究。近年來，組織透明化技術與平面光片照明顯微鏡的結合，讓完整的腦、脊髓三維成像變為可能【2】。研究者利用這些技術可以更好地探索神經系統的發育、成熟、創傷和退變過程中的結構與功能變化。

SHIELD方法【3】以保護熒光蛋白構象為出發點，對主動式組織透明化技術進行了優化，與采取有機溶劑的組織透明化（BABB, iDisco, uDisco, 3DISCO, vDISCO等）相比，具有更好的熒光保護效果，并且比被動式親水試劑透明化大大提高了處理速度（小鼠整腦透明化時間為3天），同時對于組織內核酸的保留使后續免疫雜交分析成為可能。

與傳統的基于落射熒光的成像技術不同，選擇性平面照明顯微鏡（Selective plane illumination microscopy (SPIM）)將照明平面光片限制在檢測焦平面附近，通過正交的照明光路與檢測光路獲取更好、更快的三維成像能力【4】。由于光的衍射，一片薄而大，同時又具有良好光約束能力的光片只存在于理想中。因此，在面對不同的成像需求，特別是亞微米級到厘米級的多細胞大樣本成像時，空間分辨率、光學層析能力和視場大小三者不可兼得成為限制常規選擇性平面照明顯微鏡三維成像能力的根本桎梏。平鋪光片技術是一種新型的平面光片照明顯微技術，通過對空間光調制器加載不同的相位圖實現快速平鋪短而薄的光片，從而達到擴大視場且不影響空間分辨率和光學層析能力，并獲取在視野范圍內各處成像分辨率均一的高分辨率圖像的目的【5】。利用獨特的平鋪光片技術，我們可以對經過透明化處理的大組織（包括整腦）進行高分辨三維成像，并對成像結果進行三維數據渲染和分析。

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【1】Martorell AJ, Paulson AL, Suk HJ, et al. Multi-sensoryGamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and ImprovesCognition. Cell. 2019;177(2):256-271.e22.

【2】Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing andits applications in neuroscience [published correction appears in Nat RevNeurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79.

【3】Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissuephysicochemical properties using polyfunctional crosslinkers [published onlineahead of print, 2018 Dec 17]. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.

【4】Gao L. Optimization of the excitation light sheet inselective plane illumination microscopy. Biomed Opt Express. 2015;6(3):881-890.

【5】Fu Q, Martin BL, Matus DQ, Gao L. Imaging multicellularspecimens with real-time optimized tiling light-sheet selective planeillumination microscopy. Nat Commun. 2016;7:11088.