光學顯微鏡的主要觀察方法之熒光觀察

應用專家 易海英
  熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下，幾乎同時發(fā)射出波長更長光的過程(圖1)。當特定波長(激發(fā)波長)的光照射一個分子(如熒光團中的分子)時，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10^-9–10^-8秒，在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③，會釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。

熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時間為熒光壽命，一般為納秒級別，是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進行成像的技術叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM)，可以在熒光強度成像之外，更加深入地進行功能性精準測量，獲取分子構象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學成像難以獲得的信息。
熒光的另一個重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長差異（圖2）。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前，電子經(jīng)過弛豫過程會損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進行觀察。
熒光顯微鏡是利用熒光特性進行觀察、成像的光學顯微鏡，廣泛應用于細胞生物學、神經(jīng)生物學、植物學、微生物學、病理學、遺傳學等各領域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等。
細胞中大部分分子不發(fā)熒光，想要觀察它們，必須進行熒光標記。熒光標記的方法非常多，可以直接標記（比如使用DAPI標記DNA），或利用抗體抗原結合特性進行免疫染色，也可以用熒光蛋白（如GFP，綠色熒光蛋白）標記目標蛋白，還可以用可逆結合的合成染料（如Fura-2）等。 目前熒光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標配成像設備，是我們?nèi)粘�實驗的好幫手。熒光顯微鏡主要分為三大類：正置熒光顯微鏡（適合切片）、倒置熒光顯微鏡（適合活細胞，兼顧切片）、熒光體視鏡（適合較大標本，如植物、斑馬魚（成體/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。
熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件，由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成，安裝在濾片轉輪里，如Leica DMi8配有6位濾片轉輪（圖3）。不同的顯微鏡轉輪位數(shù)會有區(qū)別，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。
濾塊在熒光成像中起著重要作用：激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品，阻擋其他波長的光；通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡（其作用是反射激發(fā)光和透射熒光），反射后通過物鏡聚焦，照射到樣品，激發(fā)出對應的熒光即發(fā)射光，發(fā)射光被物鏡收集，透過二向分光鏡，到達發(fā)射濾片。如圖4中：激發(fā)波長為450-490nm，二向分光鏡反射短于510nm的光、透過長于510nm的光，發(fā)射光接收范圍為520-560nm。 熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長通（long pass，簡稱LP）和帶通（band pass，簡稱BP）兩種類型。帶通通常由中心波長和區(qū)間寬度確定，如480/40表示可通過460-500nm的光。長通濾色片如515 LP，表示可以通過波長長于515nm的光（圖5）。
熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)（吸收）曲線和發(fā)射曲線，激發(fā)峰為最佳激發(fā)波長（激發(fā)效率最高，從而可以降低激發(fā)光能量，保護細胞和染料），發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長范圍。因此，在實驗中，我們會盡可能選擇與激發(fā)峰最接近的波長進行激發(fā)，而接收范圍需包括發(fā)射峰。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm，在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片。
濾塊的詳細信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到最匹配樣品的濾塊對于熒光成像有著至關重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會注明，也可在網(wǎng)上查閱（如https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/、https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-proteins-introduction-and-photo-spectral-characteristics/）。
濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長，對于多色標記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源，目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素燈，以及近年來飛速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的，在不同波段能量也會不同。LED光源因為其相對較窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點，正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。
除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊，還有外置快速轉輪（圖7），徠卡的外置快速轉輪相鄰位置濾片轉換速度為27ms，可實現(xiàn)高速多色實驗，如FRET及Fura2比例鈣成像（圖8）等。