新型活細胞組織全息定量相位顯微鏡技術及應用簡要介紹
Gradient Light Interference Microscopy
技術開發團隊：蓋布利爾·波佩斯庫（Dr. Gabriel Popescu)課題組，實驗室：美國伊利諾伊大學生物工程系、電氣與計算機工程系、物理系、細胞與發育生物學系 伊利諾伊大學微納米技術實驗室 先進科技研究所定量光成像實驗室 貝勒醫學院生物化學與分子生物學系
KOSTER & PHIOPTICS梯度光干涉顯微鏡系統是一種無需標記的用于厚組織樣品的三維定量斷層成像技術。GLIM技術能夠解決厚組織樣品的多重散射問題，從而提供高對比度的樣品圖像。此模塊可以做為外加設備安裝到主要品牌的顯微鏡設備上，包括KOSTER顯微鏡系統，而且可以與熒光成像通道疊加，只需要外光光源及標準的C型接口即可使用，非常方便。 廣州科適特科學儀器有限公司是本產品的授權代理，可提供定制及售后服務。梯度光干涉顯微鏡系統是一種無像差的光學裝置，適用任何有1 ×視頻接口的顯微鏡，包括明場，熒光，寬場顯微鏡等，無需額外的附件或顯微鏡改造，都能立刻轉變成強大的3D圖像平臺。
簡要介紹：
1.有別于相差顯微鏡， 數字全息顯微鏡是基于獨特的相移顯微原理。光波在經過物體表面反射或者透過物體之后，受物體表面形貌或者是物體內部不同物質折射率的影響而產生相移，這樣就攜帶上了物體的三維特征。
2.顯微鏡能夠實現三維形貌的實時呈現，得益于它非掃描機制。抓取單張全息圖的時間是由相機的快門速度決定的，因此數字全息顯微鏡能夠輕松實現普通視頻速率，比如30幀/秒。
3. 透明樣品，比如說細胞，利用傳統的相襯顯微鏡只能進行觀測。透射式的數字全息顯微鏡記錄光在經過細胞之后的相移信息，不僅能觀測細胞，還能進行三維重建和量化分析，因此也被稱為量化相襯顯微法。細胞中的相移是由細胞內不同組織細微折射率的變化引起的，因此數字全息顯微鏡觀測細胞無須對細胞進行任何標記，比如熒光染色，納米顆粒或是輻射，這樣不會對被觀測細胞造成任何損傷或是外在影響。
4. 獨特光路設計，和其他干涉技術一樣，數字全息顯微鏡產生干涉的前提是兩束光的光程差要小于相干長度。由于觀測不同大小物體需要使用不同放大倍數的物鏡，因此物光O的光程會因此改變。數字全息顯微鏡能根據不同物鏡自動調節參考光R的光程，使得兩束光的光程差總是符合產生干涉的條件，這種設計也使得各物鏡下達到共焦的效果。
5. 與共聚焦(Confocal Microscope)的比較 全息定量相位顯微鏡采用非掃描 (non-scanning) 技術，全視場瞬態成像四維量測，單幀全息圖包含三維形貌信息，縱向亞納米測量精度由激光本征波長決定，使用普通顯微物鏡便于維護保養，共聚焦顯微鏡(Confocal Microscope)同樣采用掃描技術測量靜態三維形貌，單張測量時間較長因此也無法實現四維形貌測試。
6. 無標記生物細胞觀測，得益于數字全息顯微鏡對生物細胞非侵入式的視覺化量化分析能力，多種在生物醫藥領域的應用已經得到廣泛的關注。例如圖5所示，數字全息顯微鏡可以測量單個血紅細胞的三維形貌，由于無需掃描，測量過程是實時的，因此也可以對多細胞進行動態跟蹤分析。下圖展示了數字全息顯微鏡對酵母菌的動態跟蹤，可以三維實時觀測酵母菌的移動和細胞分裂
7. 無標記細胞成像和分析工具為研究人員提供了開創性的新方法來研究單個細胞水平的細胞形態和動態行為。它們以無與倫比的穩定性和準確性追蹤單個細胞，而且無需標記，能夠持續數小時到數天而不傷害細胞。
主要特點：
1. 無需樣品準備，非侵入式成像，避免樣品染色對細胞的損傷。
2. 適合樣品厚度從50 µm – 350 µm+
3. 定量測量: 樣品厚度和干重
4. 無需樣品標記，能夠連續成像從毫秒到幾天
5. 能夠跟現有的顯微鏡系統整合在一起
6. 可進行編程的4D (tiling, z-scan, time series)掃描和全分辨率情況下12幀/秒的圖像獲取
7. 多通道圖像的無縫疊加，包括熒光通道的疊加
8. ImageJ-基礎的工具套裝進行測量和3D 圖像重構
典型應用
1. 腦組織及腦片成像
2. 器官及組織的三維成像
3. 發育生物學，胚胎研究
4. 模式動物研究 ( 蠕蟲, 斑馬魚，果蠅等)
應用介紹舉例： 無標記生物細胞觀測
得益于數字全息顯微鏡對生物細胞非侵入式的視覺化量化分析能力，多種在生物醫藥領域的應用已經得到廣泛的關注。例如圖5所示，數字全息顯微鏡可以測量單個血紅細胞的三維形貌，由于無需掃描，測量過程是實時的，因此也可以對多細胞進行動態跟蹤分析。下圖展示了數字全息顯微鏡對酵母菌的動態跟蹤，可以三維實時觀測酵母菌的移動和細胞分裂
參考文獻
[1] g. popescu (2011) quantitative phase imaging of cells and tissues (mcgrow-hill, new york)
[2] t. kim, r. zhou, m. mir, s. d. babacan, p. s. carney, l. l. goddard and g. popescu, nature photonics, 8, 256-263 (2014)
[3] m. mir, s. d. babacan, m. bednarz, m. n. do, i. golding and g. popescu, plos one, 7 (6), e38916 (2012)
