淺談如何選擇合適的光源獲得優質的熒光成像

熒光顯微鏡是利用特定波長的激發光照射被檢物體產生熒光進行鏡檢的顯微光學觀測技術，已有100多年歷史。在生物醫學領域應用廣泛，大多數實驗室都有配備高端或者常規的顯微成像系統，熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發熒光;另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

近年來，各種新型熒光染料及各種專業化的熒光探針不斷出現，例如：熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，FISH）相關試劑盒，市場上出現的探針就有十數種之多，Vysis mFISH探針試劑盒（FITC,CY5，TxR, DEAC,SP-Gold）, Abbott-FISH探針試劑盒(Spectrum Blue,Spectrum Aqua,Spectrum Green,Spectrum Gold,Spectrum Orange),Zytovision FISH (ZyBlue,DAPI,ZyGreen), Cytocell FISH探針試劑盒，其染料的譜線范圍各有差異，如何進行配置合適的熒光顯微鏡以獲得最佳的熒光檢測效果成為一個較為復雜的問題。廣州科適特科學儀器有限公司一直致力于為客戶提供定制化的熒光顯微鏡成像系統，根據客戶的反饋和我們自身的工作實踐簡單總結一下如何選擇合適的光源以獲得優質的熒光效果。

一.熒光顯微鏡簡要原理

熒光顯微鏡的基本構造通常由普通光學顯微鏡再加一些如熒光光源 、激發濾片、雙色束分離器及阻斷濾片等附件的基礎上組成。同時采用的熒光光源一般為超高壓汞燈，它可發出各種波長的光，且每種熒光物質都會有一個產生最強熒光的激發光波長 ，這時需加置激發濾片，通常有紫外、紫色、藍色及綠色激發濾片，僅需使一定波長的激發光透過并照射到標本上，并將其他光都吸收掉。

二．影響到熒光顯微鏡成像效果的因素

影響熒光顯微鏡成像的熒光因素很多，主要包括：熒光樣品的制備，熒光光源的選擇，濾片轉盤的設計，熒光濾片的組合策略（激發光濾片，發射光濾片，雙色鏡分光濾片，帶寬選擇），顯微鏡物鏡種類，顯微鏡攝像系統的選擇等問題。熒光的激發、濾光、成像、淬滅，熒光實驗的調整就是怎么才能協調好以上因素得到最好的效果，其中影響到成像效果的一個重要因素即是熒光光源。

三．熒光顯微鏡光源種類及介紹

熒光顯微鏡的常用光源通常都是白光光源：高壓汞燈，氙燈，金屬鹵素燈和LED白光光源以及高端的LED單波長光源。

1、汞燈
超高壓汞燈（50-200W），它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起汞蒸發，球內氣壓迅速升高，當汞完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使汞分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外和藍紫光，足以激發各類熒光物質，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。推薦產品：歐司朗50W，103W，200W汞燈，適用于各大廠家高端熒光顯微鏡；一般200小時壽命。

2、氙燈
氙燈和汞燈做為白光源，都能提供從紫外到近紅外一系列波長的光，但它們卻有著不同的激發光譜。汞燈集中在近紫外、藍光以及綠光附近，這種在峰值的高激發能量確保產生明亮的熒光信號，但光毒性卻很強。因此，HBO用來對固定樣品或弱熒光成像。相比而言，氙燈光源的激發比較平緩，可以用于不同波長間強度的比較，例如用于鈣離子濃度測量等。氙燈的強激發在近紅外800-1000nm。

XBO較HBO的特點：
1）光譜強度更均勻
2）在紅外及中紅外仍有較強光譜強度
3）能量較強更易到達物鏡后孔徑
此類產品：XBO75W，100W氙燈；壽命一般400小時，1200小時

3、金屬鹵素燈
目前各大顯微鏡品牌廣泛使用的一種光源，它和汞燈的激發光譜很像，但它和顯微鏡以光纖相連，能散熱，壽命更長。光纖從光源連到顯微鏡上，可以大量減少光產生的熱能。金屬鹵素燈對活細胞成像的另一個優勢是內置強度設計裝置，可以容易調節激發光。也可以通過選擇直接連接獲得更好的激發效果。例如：EXCELITAS公司X-cite光源，120W，適用于各大廠家高端熒光顯微鏡；壽命2000小時以上。廣州科適特科學儀器有限公司是此公司的授權代理商。 價格優惠，發貨速度快。

4、LED白光熒光光源
這種光源的開關在毫秒間，減少樣品在光照下的暴露時間，延長壽命。另外，LED光的衰減即快又精確，長期活細胞試驗下可大大減少光毒性。和白光相比，LED僅僅在一個較窄的光譜激發，多個LED波段使得LED光源能為多色熒光提供應用。例如：EXCELITAS公司X-cite 120LED/LED MINI光源，CoolLED熒光光源系列，PE 300 Lite/Ultra等系列。可以采用插入特定濾片及采用外部控制器并且提供SDK軟件用于二次開發，方便整合到熒光顯微鏡系統控制。

優點：
·壽命長，衰減慢，通常不需要更換燈泡及校準
·控制方便，通常配備有外部控制器
·能進行特定波長開關，減少熒光串色及熒光淬滅。
·結合多色帶通濾片組的選擇可實現無轉盤設計，減少震動。
缺點：
·光譜曲線的某些激發強度不如汞燈和金屬鹵化物光源，某些波段激發
·強度不夠。例如：CY7，DAPI染料強度比汞燈和金屬鹵化物燈弱。

光譜曲線對比

壽命對比，LED 25000小時以上

新產品：EXCELITAS公司2018年6月最近新推出X-Cite® XYLIS LED光源，可以很好的解決這個問題，全光譜360nm-770nm, 覆蓋從DAPI到CY7的熒光染料，TRITC/TxRd/mCherry的熒光探針表現優異，尤其適合FISH和體式熒光顯微鏡觀察。先進的控制系統可以采用USB/TTL/SpeedDIAL控制，還可以采用腳踏板控制，操作方便。此光源UV LED部分還具有DAPI 365nm和385nm兩種型號，更加適合DAPI激發，并且具有UV-OFF模塊降低背景噪音，考慮周到！

輸出光譜強度比較

5.LED單波長熒光光源，此類光源屬于高端的熒光光源，價格昂貴，通常需要20000美元左右哦。采用單波長LED模塊設計，輸出單個波長的熒光譜線，例如365nm/488nm/561nm/633nm, 類似于激光光源。此類優點突出；壽命長，采用光電快速切換，有效避免物理震動。LED單模塊光源的單色性好，極大的降低了白光光源的背景噪音，高效激發。程序控制適合整合到高端的成像系統中。例如：EXCELITAS公司X-CITE TURBO系統，蔡司公司的Colibri LED光源即屬于此類代表，壽命普遍在幾千個小時。

四．總結

高靈敏度固態探測器，高數值孔徑物鏡和各種不斷開發出來的基于計算機圖像分析方法，幫助生物醫學研究者進一步深入調查基于熒光的生物現象，讓研究者深入探究在自然環境中在活細胞內。同時免疫熒光在醫學研究、診斷領域里的廣泛應用，FISH、各種熒光蛋白技術分別在基因組學、蛋白質組學研究方面的推廣，生物醫學科研對儀器需要越來越高，先進的的熒光儀器和配件的發展將毫無疑問地繼續。廣州科適特科學儀器有限公司參與其中，為此領域的發展貢獻微薄力量。