活細胞評價細胞周期抑制劑——ImageXpress® Micro
前言
監測對細胞周期變化的影響對于腫瘤的發展及藥物研發有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細胞的生長。活細胞高內涵的篩選已被驗證可以區分細胞的每個周期。此技術結合BacMam轉染系統，可使細胞表達兩種細胞周期相關熒光融合蛋白。
延時監測實驗持續2-3天，細胞置于ImageXpress®Micro高內涵成像與分析系統的環境控制艙室中，整個實驗都可維持活細胞的正常生長環境。按預先設置的時間間隔，同時獲取明場和熒光的活細胞圖像。這個完整的實驗方案包括了預置模塊對延時拍攝的圖片進行分析，基于明場的圖像識別所有細胞，基于熒光蛋白的表達區分不同的細胞周期。
可視化熒光蛋白表明細胞所處周期
使用實時監測細胞周期PremoTM FUCCI細胞周期指示劑(Thermo Fisher)。在種板之前，細胞轉染熒光標記的細胞周期相關蛋白，geminin和Cdt1。Geminin為綠色的GFP，Cdt1為紅色RFP，拍攝通道分別為FITC和TRITC。由于geminin和Cdt1都只在特定的周期表達，因此，他們在細胞核中的表達可以指示細胞所處的細胞周期(圖1)。
優勢
- 活細胞在儀器內持續生長觀察長達72小時以上
- 減少實驗操作時間
- 明場無標記下識別細胞
- 應用細胞周期轉染試劑檢測周期變化
方法
1.準備細胞懸液，40,000細胞/mL的Hela細胞懸液與30顆粒/細胞濃度的FUCCI試劑混合，以4,000細胞/孔的濃度種在96孔板中，孔板置于37°C，5%CO2的環境下貼壁8小時。
2.不同濃度的有絲分裂抑制劑處理細胞，然后孔板放入ImageXpressMicro系統。
3.每隔2-3小時系統自動拍攝一次圖片，使用20倍PlanApo物鏡，同時獲取明場及兩個熒光通道FITC和TRITC的圖像。實驗持續48-72小時，細胞可完成1-2次分裂。
4.分析延遲實驗圖像使用MetaXpress?高內涵成像與分析軟件的用戶自定義模塊。
明場識別細胞，熒光蛋白區分細胞周期
活細胞使用FUCCI細胞周期指示劑，化合物處理后細胞周期的變化可以被實時監測到，比終點法檢測固定細胞能得到更多的信息。轉染了FUCCI細胞周期指示劑的Hela細胞在高內涵細胞中實時拍攝了圖像，并通過MetaXpress®高內涵成像與分析軟件的模塊進行分析，明場下識別出所有細胞，基于熒光蛋白表達區分出不同周期。表達紅色為G 1期，表達綠色為G 2/M期，同時表達紅色和綠色的為S期(圖2)。處于G0期的細胞沒有熒光信號，但是會在明場下被識別到并計入細胞總數中。另外，分裂的細胞也可被記錄。
細胞周期抑制劑可引起細胞停滯在特定周期
分析過程可使用MetaXpressPowerCore并行處理軟件加速分析速度。經過24小時化合物處理，大部分細胞停留在G0期，只有少數細胞表達了細胞周期標記蛋白。被紫杉醇和諾考達唑的細胞有一定的細胞停滯在G2/M期(圖3)。
總結
PremoTMFUCCI細胞周期指示劑結合配置環境控制的ImageXpressMicro成像系統和MetaXpress軟件，可實現高效的活細胞周期精確測量。高通量篩選技術可為科學家提供一個快速的、自動的基于圖像定量分析細胞周期的方法，并能夠完整的記錄長時間內的細胞周期變化。另外，MetaXpress軟件能夠在明場圖像識別細胞，避免了染料對活細胞的毒性。同一標準具有統計學意義的定量分析方法可評價多化合物在不同濃度對細胞周期影響的相關參數。
