細胞培養相關問題及解答(二)

1.液體培養基的保存是冷藏好？還是冷凍好？
要冷藏！因為液體培養基經冷凍后再經溶化時，其溶液的PH值會發生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會受到影響對細胞生長不利。故液體培養基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年。

2.液體培養基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。
幾乎所有的細胞對谷氨酰胺有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成蛋白質，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。所以，各種培養液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置-20 ◦C冰凍保存，用前加入培養基中。加有谷氨酰胺的液體培養基4 ◦C 冰箱儲存兩周以上時，應重新加入原來量的谷氨酰胺。

3.培養用液pH對細胞生長的影響
由于，大多數細胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。

但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環境中更利于細胞生長。因此，我們在配制培養用液時，可把液體的pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的PH還會向上浮動0.2左右。

4.常用培養基及培養用液的滲透壓范圍 
培養基名稱                滲透壓范圍（mOSM） 
DMEM（高糖）                      315 ~ 350 
DMEM（低糖）                       270 ~ 330 
RPMI-1640                      260 ~ 290 
MEM-EBSS                      280 ~ 310 
MEM-NEAA                      280 ~ 310 
McCoy5a                     280 ~ 310 
MEM-a                      280 ~ 310 
M—199                      275 ~ 305 
IMDM                       270 ~ 300 
DMEM/F-12                       280 ~ 310 
F—10                       270 ~ 300 
F—12                       275 ~ 300 

培養基名稱                 滲透壓范圍（mOSM） 
L—15                     280 ~ 320 
D-Hanks                    280 ~ 300 
Hanks                     280 ~ 300

PBS                      275 ~ 300 

5.細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？
不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養瓶，以便于將含血清的培養基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ；
（2）０.２５％胰蛋白酶＋０.０３％ＥＤＴＡ。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。 
多數細胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ這種消化液。  

6.培養基在使用過程中應注意的問題： 
（1） 培養基在使用前需37 oC預熱或在室溫平衡后再使用。 
（2） 細胞培養過程中，吸取過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，防止殘留在吸管內的培養基焦化，將有害物質帶入培養液中。 
（3） 盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間。 
（4） 避免液體間、細胞間的交叉污染。 
（5） 配制完全培養基時，配制的量最好在2周內用完為好。

7.血清的有關問題： 
新生牛血清：新出生牛5天內取血制成 
小牛血清：小牛出生16周以內采血制成。 
胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。 
國內廠家往往不能做到，經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。 
根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為： 
（1）.特級胎牛血清：40納米過濾，內毒素含量≤10EU， 血紅蛋白含量≤10mg/dl。 
（2）.優等胎牛血清：經過3次100納米過濾，內毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/ml。
（3）.標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內毒素， 低血紅蛋白含量。 
（4）.活性碳/葡聚糖處理血清：激素含量大大降低。 
（5）.透析型胎牛血清：次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 

8. 其他細胞培養用液：除培養基、血清、谷氨酰胺外，其他幾種液體也屬必須，不可省略。 
（1）雙抗：200倍，（1ml/支）其終濃度為青霉素100U/ml；鏈霉素100ug/ml，-24 oC保存。 
（2）L-谷氨酰胺：100倍，（1ml/支）， 終濃度2mM，-24 oC保存。 
（3）丙酮酸鈉：配制濃度50mM，4ml/支，終濃度為1mM/ml， -24 oC保存。 
（4）Hepes液：配制濃度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml 
完全培養基中，終濃度為25mM/ml，常溫保存。 

9.支原體污染及檢測： 
（1）支原體污染在細胞培養中最常見、不易被查覺，但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物，它無細胞壁，形態呈高度多形性，最小直徑0.2um，可通過濾器。 

目前通過對國內100余株/系細胞的檢測，形勢不容樂觀。污染率達30% ~ 60% 。課題組從國外引進細胞株/系也經常出現支原體的污染。支原體在污染細胞后，它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養基中的氨基酸來抑制細胞的生長，并能降低細胞的融合率。因此，在運用各種細胞系進行實驗研究時，首先要證明所用細胞有無支原體的污染。 

（2）支原體污染后，培養基可不發生渾濁，細胞病變輕微或不明顯，因此難以發現。目前，支原體檢測的方法有以下幾種。 
（a）相差顯微鏡觀察；
（b）.低張處理地衣紅染色法； 
（c）熒光染色法；
（d）酶標法； 
（e）PCR法：使用該方法進行檢測。 
優點：靈敏度高，檢測耗時短，樣品量小 
（只需50ul細胞培養用液上清）。 
缺點：引物及制劑費用較高。

^{_{相關鏈接：}}

• 細胞培養常見問題（一）
• 細胞株培養
• 原代細胞培養
• 各類細胞實驗