高通量篩選神經毒性實驗方案

優點：

完全自動化的圖像獲取與分析 

快速得到每個細胞的多表型參數 

實時監測活細胞的毒性，可持續幾分鐘至幾天

 

神經系統對許多毒性化合物以及自然環境中生成的有害物質非常敏感。在疾病發生過程中，神經毒性可以對大腦或者外周神經系統造成短暫或持續性的損傷，例如脊髓損傷，中風，創傷性腦損傷等。同時這種神經毒性也是造成很多神經退行性疾病諸如阿爾茲海默和帕金森的主要誘因。

 

誘導人多功能干細胞的高通量成像技術可以用于篩查候選藥物或者環境污染物的神經營養，保護功能或者神經毒性大小。本篇說明會闡述如何結合iPSCs，分子儀器和軟件自動對誘導多功能干細胞進行終點法及活細胞的神經毒性篩選。

 

誘導多功能干細胞技術對我們研究神經元毒性是十分有用的，iPSCs可以大批量的展示成熟神經元的功能。如果將這種獨特的生物學相關的細胞類型和高通量成像分析結合在一起，我們就可以快速的篩選出在引起神經元毒性中起主導作用的化合物并大大減少臨床前研究和相關動物實驗的成本。此篇中用到的是Cellular Dynamics International公司完全分化的人神經細胞。

 

高通量分析是一種定量化的分析方法，其可以測量神經突觸長度表征被測物的陽性或陰性作用。iPSC衍生的神經元細胞可以在3-5天內于96或者384孔板中形成神經元網絡，然后用毒性化合物刺激48-72小時。神經網被ß-tubulin標記后，可利用ImageXpress® Micro 寬敞成像系統獲取圖像。和抗抗體我們可以實現神經元網絡的可視化。使用MetaXpress® 圖像處理軟件中Neurite Outgrowth模塊和AcuityXpress™ 高內涵數據分析軟件對相關圖像和實驗數據進行分析。

 

無論是否進行了細胞核復染色，Neurite Outgrowth模塊都能找到神經細胞胞體，并根據這些熒光標記的神經細胞軸突將之標定為陽性細胞。神經細胞網絡具有幾個重要的特征參數包括軸突數目，軸突長度，每個細胞或者區域的分支數。我們可以針對每個孔的相關數據和細胞表型進行計算和統計。

 

上左：對照和高濃度藥物的Neurite Outgrowth模塊分析圖像結果，藍色為核，綠色為ß-tubulin III標記的神經突觸。上右：毒性化合物的總突觸計量反應曲線。下：由總突觸計量反應曲線計算出的IC50值。

 

 

上：對照和Antimycin A處理的神經元細胞圖像，細胞被JC-10染色。圖像所示為20倍鏡拍攝。下：計量反應曲線繪制依據每個細胞平均線粒體/顆粒數比值。

 

線粒體膜的去極化過程被認為是缺氧性損傷和細胞毒性的重要早期標志，運用JC-10染料可以對線粒體膜電位進行監測。在正常細胞中，聚集在線粒體中的JC-10呈橘紅色，而當線粒體內膜電位降低后，JC-10則從線粒體中以單體形式釋放到細胞質中并發出綠色熒光。 用JC-10對神經細胞進行染色并用抗霉素或者氨基霉素處理30min，后兩者可以有效阻斷細胞的氧化呼吸過程及鈣離子過載。用戶可以自定義MetaXpress Software 中的Granularity模塊來識別線粒體中JC-10的密度和大小。數據結果將被標準化到每個視野。

 

運用Calcein AM和Hoechst核染料我們可以對活細胞的毒性進行檢驗。ImageXpress Micro 系統可很好的控制培養板的溫度，CO2濃度以及濕度等環境因素，從而準確的檢測化合物是否具有神經毒性（圖3）。通過對比體內檢測出的具有神經毒性的化合物以及臨床數據，我們就可以對化合物的神經毒理特性進行預測。

Calcein AM可以同時對活的神經細胞胞體和外放的神經纖維進行染色。利用Neurite Outgrowth 應用模塊分析神經細胞網絡，Cell Scoring 應用模塊區分活體和死體神經細胞。

 

上：圖片所示為不同濃度methyl mercury對神經元細胞的毒性作用。Calcein AM的存在說明活細胞代謝活動（綠色）。下左：毒性化合物的IC₅₀曲線，依據測量的神經突觸和細胞核大小顯示的毒性所繪制。下右：Hoechst染色的細胞核被標記為紅色。

 

Molecular Devices公司的ImageXpress Micro 系統，MetaXpress 軟件和 AcuityXpress 軟件完美的解決了如何篩選評估神經元毒性化合物的問題。活細胞篩選技術和成熟的表型成像分析技術相結合可以有效的鑒別神經毒性化合物，從而為早期的藥物研發提供強力支持。