蛋白質芯片的原理、分類及一般操作步驟概述

蛋白質芯片的原理、分類及一般操作步驟概述 

概述 

蛋白質芯片亦被稱為蛋白質微陣列, 蛋白芯片的技術最早由Roger Ekin在上世紀80年代就已提出,它是將大量蛋白質分子按預先設置的排列固定于一種載體表面形成微陣列, 根據蛋白質分子間特異性結合的原理, 構建微流體生物化學分析系統, 以實現對生物蛋白分子準確、快速、大信息量的檢測, 是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質分析技術. 簡單地說, 就是一次試驗中同時檢測幾百甚至幾千種目標蛋白/多肽的分析技術.
 
 

基本原理

將各種蛋白質有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上，然后，用標記了特定熒光的蛋白質或其他成分與芯片作用, 經漂洗將未能與芯片上的蛋白質互補結合的成分洗去,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術, 測定芯片上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系,由此達到測定各種蛋白質的目的.
 

 固定在芯片上的蛋白可以是：抗原、抗體、小肽、受體和配體、蛋白質-DNA和蛋白質-RNA復合物等.
 

而抗體芯片是蛋白質芯片的主要類型,它的稱謂來源于免疫學角度,由于其在微生物感染檢測中巨大的潛在應用價值而引起人們廣泛的興趣,是蛋白質芯片研究中進展速度較快的一個分支。其主要檢測方法有雙抗體夾心法,樣品標記法. 
 
以Raybiotech公司的抗體芯片為例:

夾心法的原理圖:
 
捕獲抗體排列于膜或玻片上，加入樣品孵育，再加入目標蛋白的生物素標記抗體，最后，HRP-鏈霉親和素或熒光素-鏈霉親和素用于檢測芯片信號。

樣品標記法原理圖:
 


樣品中的蛋白用生物素標記，然后與捕獲抗體一起孵育，對照蛋白加入到樣品中來監測整個反應過程，包括生物素標記和標準化。結合在芯片上的蛋白利用HRP-鏈霉親和素來檢測，最后采用化學光或者HiLyte™Fluor 555-鏈霉親和素來檢測信號。
 

一般分類 ：
根據應用分類:
    1.蛋白檢測芯片---- 將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用于識別復雜生物樣品中的目標蛋白/多肽。根據檢測方法,不同蛋白質檢測芯片又可進一步分為正相蛋白質檢測芯片和反相蛋白質檢測芯片。 

正相蛋白質檢測芯片首先用不同的熒光標記物對樣品中的擬研究的蛋白質進行標記, 再將這些樣品在抗體微陣列上進行溫育, 然后用生物芯片掃描儀檢測各個陣列分子點上熒光信號。

反相蛋白質檢測芯片是用破碎的微量組織或者細胞樣品點樣制成的芯片, 代表在某種狀態下整個細胞的蛋白質,然后用特定抗體進行檢測。

2.蛋白功能芯片----天然蛋白點加在基片上，了解體系中哪種蛋白能與已知的某種蛋白結合，用于天然蛋白活性及分子親和性研究。

 

根據載體分類

1玻片芯片 
（圖為Raybiotech 公司的一種玻片芯片,共有16個子陣列,每個陣列可以檢測多個指標.可用于定量檢測。）
 
 

2膜芯片(用PVDF,或NC膜作為載體)
 
（圖為1個子陣列的膜芯片）

蛋白芯片一般的操作步驟 :
(以抗體芯片為例)
 


整個操作流程包括：
1.從組織或細胞、體液中進行蛋白質抽提；
2.用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記兩個樣品；
3.洗去多余的標記分子；
4.與芯片雜交孵育；
5.掃描分析結果。

蛋白芯片的信號檢測與數據片理
目前主流蛋白質芯片的信號檢測方式主要還是嫁接了核酸芯片的熒光檢測體系。將蛋白樣品或二級抗體標記上合適的熒光物質，通過共聚焦熒光掃描儀或C C D熒光成像儀在特定的波長下激發熒光，獲得反應結合的信號。除了此類熒光標記檢測外，另一類更引人矚目的就是非熒光標記檢測技術。后者的代表諸如重力懸臂( s t r e s s )技術、表面核磁共振技術、S P R ( s l l r f a e e   p l a s m o n  F e s o n a n c e ) 。此外又如基于聲學及光學原理的A c o u s t i c   P l a t e  Mo d e 、橢圓光學檢測。他們的共同的特點是：高靈敏度，滿足了微量蛋白的檢測需要，但缺點是過高的靈敏度往往使得垃圾信號和有效信號的區分變得困難。  

示范圖:
為蛋白質芯片1 個子陣列的放大圖.
子陣列中看到的點狀就是蛋白質芯片
內信號的強弱表達. 可以通過多種儀器檢測

在數據處理方面，目前蛋白質芯片的數據處理主要集中在如何根據熒光強度對蛋白濃度的定量上.由于生物樣品中各種可能的目的分子的含量存在巨大的差異以及蛋白間作用動力學的多樣性和復雜性，如何分假陽性信號和陽性弱信號有待解決.
 
蛋白質芯片較傳統分析方法主要有以下優點 :
1所需樣品量極少----微量化(10-100μl);
2蛋白芯片上可以實現成千上萬個目標蛋白質的高通量平行分析-----高通量;
3有高的信噪比，高準確性、高靈敏度(單克隆抗體);
4快速、微型化和自動化;
5可通過標準曲線來進行定量檢測;
6在整個基因組和蛋白質組水平將ＤＮＡ序列信息與蛋白質產物直接聯系起來.

蛋白質芯片的主要應用
 

    蛋白質芯片的發展趨勢
蛋白質芯片發展的下一步是能夠分析整個蛋白質組，也就是說在一張芯片上排列至少5 千至1 萬個蛋白質。