環氧合酶-2 (COX-2) ELISA使用說明書

 

COX是一種膜結合酶，負責花生烯酸氧化生成前列腺素G2（PGG2）以及隨后PGG2轉變為PHG2。這是各種前列腺素生成的第一步。COX至少有兩種不同的亞型，組成表達型COX-1，和誘導型COX-2。COX-1行使著看家功能，如血管止血，腎流血量，腎小球功能維護。COX-2存在于部分細胞內，發出炎癥信號，如生長因子，細胞因子和內毒素。

試劑盒采用夾心酶免法，采用了兩種高特異性抗體，TMB作為著色劑，最終溶液所顯示的顏色強度與樣品中COX-2的量成正比

檢測范圍

1.09~70ng/mL

1.       試劑盒可用于細胞上清裂解液中人COX-2的檢測

細胞培養液

1）    將細胞培養液（1x10⁵~1x10⁷個細胞）加入至0.5ml的IBL裂解液中（貨號為#19022）

2）    在振蕩器上混勻或用移液槍吹打混勻

3）    2-8℃下旋轉30min使其溶解

4）    2-8℃，10000rpm下離心10min

5）    有必要的話用EIA緩沖液稀釋上清液

2.       細胞裂解液試驗中，建議所用細胞數應一致

3.       建議總蛋白濃度也同時檢測，可檢測到人COX-2與總蛋白的關系

1.       微孔板，96孔，包被有抗人COX-2鼠IgG單抗

2.       酶標抗體濃縮液，30X，HRP標記的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml

3.       標準品，重組人COX-2，0.5mlx2

4.       EIA緩沖液，30ml

5.       酶標抗體稀釋液，內含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml

6.       顯色劑，TMB，15ml

7.       終止液，1N硫酸，12ml

8.       洗滌緩沖濃縮液，50ml，40X，0.05%吐溫20的磷酸緩沖液

1.     酶標儀（450nm）

2.     微量移液器和取樣吸頭

3.     帶刻度的量筒與燒杯

4.     蒸餾水

5.     溫育器（37℃±1℃）

6.     冷床箱（4℃）

7.     坐標紙（log/log）

8.     吸水紙

9.     用于稀釋標準品的試管

10.  洗滌瓶

11.  酶標抗體稀釋的一次性試管

1.       洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內，并于2周內用完

2.       標記抗體的制備：用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍，即得。

例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體濃縮+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）

此步驟在實驗前完成

剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內，保存在4℃

3.       標準品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到140ng/ml的人COX-2標準品

4.       標準品的稀釋：準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號管                 70 ng/ml

2號管                 35ng/ml

3號管                 17.5ng/ml

4號管                 8.75ng/ml

5號管                 4.38ng/ml

6號管                 2.19ng/ml

7號管                 1.09ng/ml

8號管                 0pg/ml（試驗樣品空白）

吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續稀釋，標準品范圍為70~1.09ng/ml

5.       樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋

使用前，所有樣品應平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行

1.     確定好空白孔，并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2.     確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。

3.     蓋板，37℃孵育60min

4.     用洗瓶洗板，在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復7次，最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，再用洗瓶洗3次。

5.     每孔加入100ul酶標抗體。

6.     蓋板，4℃下溫育30min

7.     按照步驟4）洗板9次

8.     將所需量的顯色劑加入到試管中，然后每孔內加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑倒入顯色劑原裝瓶中。

9.     室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色

10.  每孔中加入100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色。

11.  除去包被板孔底的雜質或水滴，同時確保液體表面無泡沫， 30min內在450處讀取OD值。

1.     樣品采集后應立即檢測，如需貯存的，則應放置在冰凍條件下，避免反復凍融，檢測前應在低溫下將其溶解并完全混合

2.     如有需要，樣品可用EIA緩沖液稀釋

3.     建議試驗樣品和標準品做雙份檢測

4.     試驗樣品應在中性PH范圍內，有機溶劑的污染會影響試驗

5.     只能使用試劑盒內提供的洗滌液洗板，洗板不充足可能會導致試驗失敗

6.     徹底倒去洗滌液，吸水紙上拍干，不能用吸水紙擦拭微孔

7.     底物液應避光保存，因其對光敏感，且要避免接觸金屬

8.     加入終止液后30min內讀數

繪制標準曲線前，將所有的檢測孔（包括標準品和未知樣品）的OD值都減去檢測樣品空白孔的OD值。在對數坐標紙上，以標準品的OD值（減去空白后的值）對其相應的濃度，通過這些點作一條平滑的標準曲線。我們可以從標準曲線上讀取未知樣品的濃度值。

典型標準曲線

附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數，如坐標參數（線性，半對數）和計算方式參數（三次回歸、四參數或雙對數曲線方程），即可直接得到結果

 

 

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。