VEGF ELISA試劑盒使用說明書
VEGF ELISA試劑盒
日本IBL原裝進口，貨號：27171
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前言說明
血管內皮生長因子（VEGF）是一種同型二聚體蛋白，最初人們是從富含正常牛垂體濾泡星形蛋白細胞的基質中分離純化得到，由各種血管組織分泌。后來人們發現VEGF與一種血管通透因子（VPF）相同， VPF是之前在富含腫瘤細胞系的基質中鑒別得到的，腫瘤細胞可以提高毛細血管的通透性。據報道，VEGF的活性包括促進內皮細胞的生長，促進血管的生成和提高毛細血管的通透性。VEGF是一種分子量為38.2kDa的同型二聚體，它由兩條含165個氨基酸的多肽鏈組成。多數人腫瘤細胞都會分泌VEGF，包括：人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、纖維肉瘤、HL60早幼粒細胞性白血病、GS-9L神經膠質瘤和U937淋巴瘤細胞。一些正常的組織也會分泌VEGF，如：活化的巨噬細胞、角質化細胞、肝細胞、平滑肌細胞、間質細胞、胚胎成纖維細胞、支氣管及脈絡叢上皮細胞，腎小球內臟上皮及其系膜細胞。IBL公司的人VEGF ELISA試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養上清中VEGF的定量檢測。
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，最終溶液所顯示的顏色強度與樣品中VEGF的量成正比。
測定范圍
15.63～1000pg/ml （第一次溫育：37℃下溫育60min）
7.81～500pg/ml （第一次溫育：4℃下溫育過夜）
預期用途
此試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養液上清EGF的體外定量檢測。此試劑可識別天然的和重組的VEGF。利用夾心法的酶聯免疫吸附實驗，采用用了高特異性的多克隆抗體和單克隆抗體。
試劑盒成分
1） 包被板：微孔中包被了抗人VEGF-1（16F1）的鼠IgG單克隆抗體，96孔。
2） 濃縮型酶標抗體：HRP標記的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml
3） 標準品：內含重組的人VEGF 165，0.5ml×2
4） EIA緩沖液：1%的BSA，含0.05%的吐溫的PBS，30ml
5） 酶標抗體稀釋液：內含的1%BSA、0.05%吐溫20的PBS，12ml
6） 顯色劑：TMB底物液，15ml
7） 終止液：1N的H2SO4，12ml
8） 濃縮洗滌液：內含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。
實驗所需器材但試劑盒不提供
l 酶標儀（450nm）
l 帶刻度的量筒與燒杯
l 孵箱（37℃±1℃）
l 吸水紙
l 冰箱（4℃）
l 試管
l 微量移液器和取樣吸頭
l 去離子水
l 坐標紙（log/log）
l 用于稀釋標準品的試管
l 洗滌瓶
試劑準備
1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內，并于2周內使用
2. 標記抗體的制備：用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍，即得。
例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）
此步驟在實驗前完成
剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內，保存在4℃
3. 標準品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到2000pg/ml的人VEGF標準品
4. 標準品的稀釋：準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 1000pg/ml
2號管 500pg/ml
3號管 250pg/ml
4號管 125pg/ml
5號管 62.5pg/ml
6號管 31.25pg/ml
7號管 15.63pg/ml
8號管 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續稀釋，標準品范圍為1000~15.63pg/ml
5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有估計，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品的最佳稀釋比例
實驗步驟
使用前，所有樣品應平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行
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試劑 |
檢測樣品 |
標準品 |
檢測樣品對照孔 |
試劑對照孔 |
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檢測樣品100ul |
稀釋標準品（1-7管）100ul |
EIA緩沖液（第8管） 100ul |
EIA緩沖液100ul | |
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蓋板，37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜 | ||||
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洗板7次 | ||||
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酶標抗體 |
100ul |
100ul |
100ul |
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蓋板，4℃下溫育30min | ||||
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洗板9次 | ||||
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顯色劑 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
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室溫避光溫育30min | ||||
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終止液 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
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加終止液后30min內450nm處讀取OD值 | ||||
1） 確定好空白對照孔，并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2） 確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。
3） 蓋板，37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
4） 用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復7次，最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，在用洗滌瓶洗3次。
5） 每孔加100ul酶標抗體，除試劑空白對照孔外
6） 蓋板，4℃下溫育30min
7） 按照步驟4）洗板9次
8） 將所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9） 室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）在每孔加100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色。
11） 擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內，在酶標儀450nm處讀數
特別注意
1. 試驗樣品采集后應立即檢測，凍存的樣品避免反復凍融，檢測前應先將其完全溶解混勻
2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3. 試驗樣品和標準品應做雙份檢測
4. 試驗樣品應在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測
5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導致試驗失敗
6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭
7. TMB底物液應貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內必須酶標儀讀數
9. 肝素血漿樣品的檢測值低于EDTA血漿樣品
結果計算
繪制曲線前，所有的數據都應減去試驗樣品空白值，包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數-對數坐標紙上繪制標準曲線，從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數，如坐標參數（線性，半對數）和計算方式參數（三次回歸、四參數或雙對數曲線方程），即可直接得到結果
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。
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