德國IBL肺炎衣原體IgM ELISA試劑盒使用說明書

(貨號：RE57051)

 

衣原體是一種不能運動的革蘭氏陽性菌，同時也是一種強制性的胞內(nèi)寄生菌，而且這種細菌可在其寄主細胞的胞漿內(nèi)形成明顯的包涵體。這種包涵體在光學(xué)顯微鏡下很容易看到。目前人們知道有三種不同的衣原體對人具有至病性，它們是：沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡衣原體，還有一種對動物具有至病性的衣原體（獸類衣原體）。沙眼衣原體是世界上性傳播疾病最流行的傳播因子（4000-5000萬例），并且此傳染病的數(shù)量還在不斷增加。感染了沙眼衣原體的孕婦可以在分娩時將病毒傳染給胎兒，從而導(dǎo)致胎兒患結(jié)膜炎或肺炎。 衣原體感染不治療的個體會導(dǎo)致慢性輸卵管炎，并且很有可能出現(xiàn)宮外孕或不孕。在男性中，沙眼衣原體是導(dǎo)致非淋球菌性尿道炎的主要因素。在衣原體感染中，頻繁性的無癥狀隱性階段是一個很嚴(yán)重的問題，因為它可能啟動慢性疾病。在許多例子中，原發(fā)性感染都沒有被發(fā)現(xiàn)，之后只能檢測到由持續(xù)上升病原體而引起的后遺癥。

可通過以下方法來檢測是否感染：

n        鏡檢：Giemsa染色

n        PCR

n        血清學(xué)：用ELISA檢測抗原

           用IF、EIA或ELISA檢測抗體

IBL公司的肺炎衣原體IgM ELISA試劑盒可用于人血清中抗肺炎衣原體IgM抗體的定性檢測。

抗肺炎衣原體IgM抗體的定性免疫酶檢測利用的是ELISA技術(shù)。包被板上預(yù)先包被了能結(jié)合樣本中相關(guān)抗體的肺炎衣原體抗原。洗板以除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)，之后加入辣根過氧酶標(biāo)記的抗人IgM。之后，酶標(biāo)物會結(jié)合到捕獲的肺炎衣原體特異性抗體上，加入能產(chǎn)生藍色反應(yīng)產(chǎn)物的TMB底物液后，如果顯示藍色則可知已形成免疫復(fù)合物。所顯示顏色的強度與樣品中肺炎衣原體特異性IgM抗體的量成正比。加入硫酸以終止反應(yīng),以便產(chǎn)生黃色的終點顏色。用一酶標(biāo)儀在450m處讀取OD值。

4.1試劑盒成分

1)      肺炎衣原體包被板（IgM）：12×8，可拆，微孔中包被了肺炎衣原體抗原，真空密封。                           

2)      IgM樣本稀釋液：1瓶，100ml，用于樣品的稀釋，內(nèi)含抗人IgG，PH為7.2±0.2，即用，綠色白蓋。

3)      終止液：待用硫酸，1 瓶，15ml，內(nèi)含硫酸，0.2mol/l，紅蓋。             

4)      濃縮洗滌液（20X）：1瓶，50ml，PH為7.2±0.2 ，白蓋。          

5)      肺炎衣原體抗IgM酶標(biāo)物：1瓶，20ml，內(nèi)含過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgM，紅色黑蓋。即用。

6)      TMB底物液，1 瓶，內(nèi)含TMB，黃蓋，15ml，即用。

7)      肺炎衣原體IgM陽性質(zhì)控，1 瓶    ，黃色液體，2ml，紅蓋

8)      肺炎衣原體IgM臨界質(zhì)控，1 瓶    ，黃色液體，2ml，綠蓋

9)      肺炎衣原體IgM陰性質(zhì)控，1 瓶    ，黃色液體，2ml，藍蓋       

4.2 實驗所需材料和器材

1)      酶標(biāo)儀，可在450/620測吸光度值

2)      37℃孵化器

3)      手工或自動微孔清理設(shè)備

4)      10µl和1000µl的取樣吸頭

5)      旋渦混合器

6)      去離子水或蒸餾水

7)      試管

8)      記時器

5.1用人血清做為樣本。如果檢測在樣品收集后24小時內(nèi)進行，則樣品應(yīng)當(dāng)存放與2-8℃的環(huán)境下；否則應(yīng)當(dāng)將其貯存于-70℃—20℃的環(huán)境下。如果樣品被凍存過，則在檢測之前應(yīng)小心解凍樣品，避免反復(fù)凍溶。

5.2樣品的稀釋

檢測前，所有的每樣品都應(yīng)按1：100的比例當(dāng)用IgM樣品稀釋液進行稀釋。在10µl樣品中加入1ml IgM樣品稀釋液，旋渦混合器上完全混合。陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控不需要稀釋，待用。

實驗開始之前仔細閱讀操作步驟，嚴(yán)格遵守操作步驟才可以獲得可靠的實驗結(jié)果。如果這實驗是在ELISA自動系統(tǒng)上進行，為了避免洗板的影響，我建議在洗板步驟時，洗板3次改成洗板5次，洗滌液從300µl增加到350µl。實驗開始之前，應(yīng)當(dāng)在試劑盒提供的結(jié)果單上標(biāo)記好所有的樣品和質(zhì)控品。取適當(dāng)數(shù)量的板條置于板架上。

請至少做以下幾個孔：

1孔（例A1）做空白對照孔

1孔（例B1）做陰性質(zhì)控

2孔（例C1+D1）做臨界質(zhì)控

1孔（例E1）做陽性質(zhì)控

如果有必要的話，我們建議您質(zhì)控和病人樣品做雙份檢測。照說明書給出的實驗步驟進行操作，并避免不同步驟之間的時間隔無明顯差別。加每一質(zhì)控品和樣品時都應(yīng)當(dāng)用新的取樣吸頭。把恒溫箱調(diào)至37 ± 1℃

1)      加100µl質(zhì)控品或已稀釋樣本于相應(yīng)反應(yīng)孔中，留A1孔做空白。

2)      蓋板

3)      37℃±1℃下溫育60+5分鐘。

4)      溫育之后，移去粘性金屬板，棄去孔內(nèi)反映液，用300µl洗滌液洗板3次，每次洗板循環(huán)間的時間間隔應(yīng)大于5秒，并在吸水紙上拍干。

注意：洗板很重要，如果洗板不充分，則檢測結(jié)果會不精確，而且會錯誤的提高OD值。

5)      除空白孔外，加100µl 肺炎衣原體抗IgM酶標(biāo)物于各孔中，蓋板。

6)      37℃±1℃下避光溫育30+2分鐘。。

7)      重復(fù)步驟4。

8)      每孔加100µl TMB底物液。

9)      室溫避光溫育30分鐘。

10)  以加底物一樣的順序和速度在每孔中加入100µl終止液。

11)  30分鐘內(nèi)在450nm讀吸光度。

1）必須符合以下條件, 實驗結(jié)果才能成立.

空白孔A1：OD＜0.100

陰性質(zhì)控孔B1：OD＜0.200

臨界質(zhì)控孔C1和D1：OD值界于0.250---0.900

陽性質(zhì)控孔E1：OD大于或等于臨界

2）結(jié)果計算：cut-off值是臨界質(zhì)控檢測結(jié)果的平均值

例如：臨界質(zhì)控OD值1.44+臨界質(zhì)控OD值0.42=0.86/2=0.43

Cut-off值=0.43

3）結(jié)果解釋：

如果樣品的OD值比cut-off值高10%以上則認為此樣品呈陽性

如果樣品的OD值在比cut-off值高或低10%的范圍內(nèi)，則認為次樣品是可疑的。（灰色區(qū)域）建議2-4周后用新鮮樣品重復(fù)檢測，如果結(jié)果仍位于灰色區(qū)域內(nèi)，在認為此樣品為陰性。

如果OD值比cut-off值低10%以上則認為此樣品呈陰性。

4）實驗結(jié)果的單位

Cut-off值

0.43

臨界值：10U

灰色區(qū)域：9-11U

陰性：＜9 U

陽性：＞11 U

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。