褪黑激素硫酸鹽ELISA試劑盒使用說明

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褪黑激素硫酸鹽ELISA試劑盒使用說明

（德國IBL：RE54031）

1、應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人尿液中褪黑激素硫酸鹽（又叫6-羥基褪黑激素硫酸鹽和6-硫酸褪黑激素）的體外定量檢測。

2、前言說明

松果體因其在光周期現(xiàn)象中的重要作用，已經(jīng)被人們認(rèn)為是神經(jīng)內(nèi)分泌的傳感器。松果體主要分泌的激素是：N-乙酰-5-甲氧色胺和褪黑激素，褪黑激素一般是由色氨酸合成而來的。血漿褪黑激素的濃度可在夜間達(dá)到最好。褪黑激素特有的波動(dòng)變化可以反映出一些關(guān)于時(shí)間變化的信息，如夜晚的長短。褪黑激素的分泌會(huì)受到神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。交感神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)褪黑激素分泌方面發(fā)揮有重要作用，它主要是通過釋放去甲腎上腺素來調(diào)節(jié)的。據(jù)報(bào)道，褪黑激素分泌方式和水平的變化與人的一些生理狀態(tài)一致，如：失眠、時(shí)差感、情緒低落、壓力大、精神分裂癥、丘腦下部性閉經(jīng)、妊娠、神經(jīng)想食欲缺乏、某些癌癥、免疫系統(tǒng)紊亂和青春期性成熟的影響。大多數(shù)循環(huán)褪黑激素都可在肝內(nèi)代謝成6-羥基褪黑激素，之后變成6-硫酸褪黑激素而隨尿液排除。尿液中6-羥基褪黑激素硫酸鹽的濃度與血液中褪黑激素的總水平有很好的相關(guān)性。

3、實(shí)驗(yàn)原理

此ELISA試劑盒利用的是競爭法的原理。樣品中未知量的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭性結(jié)合到包被在微孔中的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。溫育后洗板以終止競爭反應(yīng)。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成反比。樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。

4、儲存與穩(wěn)定性

試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運(yùn)輸和儲存，避免太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。如果將包被板密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下時(shí)，試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。

5、樣品的采集與儲存

尿液

實(shí)驗(yàn)必須使用自然產(chǎn)生的尿液，也可使用24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的尿液。收集病人24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的尿液，將它加入到含10-15ml 6N HCl防腐劑的容器中。為了計(jì)算結(jié)果，請確定尿液的總體積。實(shí)驗(yàn)開始前請先將樣品離心。
儲存	2-8℃	2-8℃	避免太陽直射，避免反復(fù)凍融
穩(wěn)定性	4天	15年	避免太陽直射，避免反復(fù)凍融

6、試劑盒成分

數(shù)量	標(biāo)記	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，多克隆）。
1×5ml	ANTISERUM	褪黑激素硫酸鹽抗血清，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞
1×0.2ml	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物，40倍濃縮，內(nèi)含過氧酶標(biāo)記的褪黑激素硫酸鹽、Tris緩沖液和1%的硫柳汞。
1×7×0.1ml	CAL A-G	標(biāo)準(zhǔn)品A-G，0;1.7; 5.2; 15.6; 46.7; 140; 420ng/mL 0;5.2;15.9;47.6;142;427;1281nmol/L。即用，內(nèi)含褪黑激素硫酸鹽、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞。
1×2×0.1ml	CONTROL 1+2	質(zhì)控品1+2，即用，內(nèi)含0.02%的；硫柳汞。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽。
1×60ml	ASSAYBUF CONC	檢測緩沖液，紅色，即用，內(nèi)含Tris緩沖液、BSA和0.01%的硫柳汞。
1×50ml	WASHBUF CONC	洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。
1×0.9ml	TMB SUBS CONC	TMB底物液，31倍濃縮，內(nèi)含TMB、緩沖液和穩(wěn)定劑。
1×27ml	TMB緩沖液	TMB底物緩沖液，儲存時(shí)避免太陽直射，即用，內(nèi)含H₂O₂、檸檬酸鹽緩沖液和穩(wěn)定劑。
1×12ml	TMB STOP	TMB終止液，即用，1M的H₂SO₄。
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）移液器，體積：10; 50; 100; 1000ul

2）試管（12×75mm）

3）試管架

4）振蕩器（500rpm）

5）旋渦混合器（500rpm）

6）帶儲器的8道移液器

7）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)

8）酶標(biāo)儀（參考波長：600-650nm）

9）蒸餾水或去離子水

10）吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

8、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說明

8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋/溶解	成分		稀釋劑	比例	備注	儲存	穩(wěn)定性
15ml	洗滌液	300ml	雙蒸水	1：20	18-25℃將晶體溶解掉	2-8℃	4周
50ul	酶聯(lián)物	2ml	檢測緩沖液	1:41	臨時(shí)配置,只能使用一次	18-25℃	30min
300ul	TMB底物液	9ml	TMB底物緩沖液	1：31	臨時(shí)配置,只能使用一次	18-25℃	10min

8.2標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人尿液樣品的稀釋

1	將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人尿液樣品分別10ul加入到聚苯乙烯或聚丙烯或玻璃試管中，避免太陽直射。
2	在每一試管中加入500ul檢測緩沖液，旋渦混合。

褪黑激素硫酸鹽濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度的樣品必須用檢測緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。

9、實(shí)驗(yàn)步驟

1	將已稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。
3	在每一微孔內(nèi)加入50ul褪黑激素硫酸鹽抗血清。
4	蓋板，室溫（18-25℃）包被板振蕩器（500rpm）溫育2小時(shí)。
5	在溫育快要結(jié)束的10分鐘前，請將TMB底物液準(zhǔn)備好。
6	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干以除出殘余液體。
7	如果可以的話，請用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同，使用
8	在每一微孔中加入200ul TMB底物液。
9	室溫（18-25℃）包被板振蕩器（500rpm）溫育30min。
10	在每一微孔中加入100ul TMB終止液，輕請振板以混合溶液。
11	加終止液后60min內(nèi)在450nm處讀取OD值。

10、期望值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作確定治療結(jié)果的唯一因素，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測相結(jié)合。以下為明顯正常人群褪黑激素硫酸鹽的正常值：

年齡	數(shù)目	褪黑激素硫酸鹽
		24小時(shí)尿液（ug）		夜間尿液（ug/h）
		平均值	90%的比例	平均值	90%的比例
20-35	26	36.8	15.6-58.1	2.8	0.9-5.6
36-50	17	29.6	9.9-52.9	2.1	0.6-3.6
51-65	16	20.4	12.3-32.8	1.5	0.9-2.5
＞	16	15.8	7.5-32.7	1.0	0.3-2.3

建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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