褪黑激素ELISA試劑盒使用說(shuō)明

（德國(guó)IBL：RE54021）

此試劑盒可用于人血清和血漿中褪黑激素的體外定量檢測(cè)。

松果體因其在光周期現(xiàn)象中的重要作用，已經(jīng)被人們認(rèn)為是神經(jīng)內(nèi)分泌的傳感器。松果體主要分泌的激素是：N-乙酰-5-甲氧色胺和褪黑激素，褪黑激素一般是由色氨酸合成而來(lái)的。血漿褪黑激素的濃度可在夜間達(dá)到最高。褪黑激素特有的波動(dòng)變化可以反映出一些關(guān)于時(shí)間變化的信息，如夜晚的長(zhǎng)短。褪黑激素的分泌會(huì)受到神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。交感神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)褪黑激素分泌方面發(fā)揮有重要作用，它主要是通過(guò)釋放去甲腎上腺素來(lái)調(diào)節(jié)的。據(jù)報(bào)道，褪黑激素分泌方式和水平的變化與人的一些生理狀態(tài)一致，如：失眠、時(shí)差感、情緒低落、壓力大、精神分裂癥、丘腦下部性閉經(jīng)、妊娠、神經(jīng)想食欲缺乏、某些癌癥、免疫系統(tǒng)紊亂和青春期性成熟的影響。大多數(shù)循環(huán)褪黑激素都可在肝內(nèi)代謝成6-羥基褪黑激素，之后變成6-硫酸褪黑激素而隨尿液排除。尿液中6-羥基褪黑激素硫酸鹽的濃度與血液中褪黑激素的總水平有很好的相關(guān)性。

此ELISA試劑盒利用的是競(jìng)爭(zhēng)法的原理。生物素和非生物素標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合包被板上有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)。生物素抗原結(jié)合到抗體上的量與樣品中抗原的量成反比。系統(tǒng)達(dá)到平衡后，洗板除去游離的生物素抗原，結(jié)合到抗體上的生物素抗原可以用抗生物素堿性磷酸酶標(biāo)記物和對(duì)硝基苯磷酸底物檢測(cè)出來(lái)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣品的酶活性與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較就可以定量出未知樣品的量。

試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運(yùn)輸和儲(chǔ)存，避免太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述,如果將包被板密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下時(shí),試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。用甲醇洗提后的提取柱可用于其它樣品的提取或儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。提取柱可重復(fù)使用4次。

按照靜脈穿刺的常規(guī)注意事項(xiàng)采集樣品，血液樣品自采集到實(shí)驗(yàn)時(shí)都必須保證其化學(xué)完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品�；鞚岬臉悠窇�(yīng)當(dāng)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前離心以除去所有的顆粒性物質(zhì)。
儲(chǔ)存	2-8℃	≤-20℃	≤-70℃	避免太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。
穩(wěn)定性	24小時(shí)	3個(gè)月	1年

 

數(shù)量	標(biāo)記	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，多克�。�。
3×2ml	BIOTIN LYO	褪黑激素生物素，凍干，內(nèi)含穩(wěn)定劑。
3×2ml	ANTISERUM LYO	褪黑激素硫酸鹽抗血清， 凍干粉，內(nèi)含抗血清（兔，多克�。┖头�(wěn)定劑。
1×250ul	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物，80倍濃縮，內(nèi)含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體（羊）、Tris緩沖液和穩(wěn)定劑。
1×6×2ml	CAL A-F LYO	標(biāo)準(zhǔn)品A-F，凍干粉，內(nèi)含穩(wěn)定劑，提取濃度請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽或QC質(zhì)控品。
1×2×2ml	CONTROL 1+2 LYO	質(zhì)控品1+2，凍干粉，內(nèi)含穩(wěn)定劑，濃度/可接受范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽。
1×50ml	ASSAYBUF CONC	檢測(cè)緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和穩(wěn)定劑。
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋中，內(nèi)含對(duì)硝基苯硫酸鹽。
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含二乙醇氨和水。
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
2×10	EXTRCOL	提取柱，即用，C18 RP，1m3/100mg。另需提取柱可從IBL定夠（編號(hào)：KEME761）
3×	FOIL	粘性金屬板

1）移液器，體積：50; 500ul

2）試管（12×75mm）

3）軌道振蕩器（400-600rpm）

4）旋渦混合器

5）帶儲(chǔ)器的8道移液器

6）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)

7）離心機(jī)（冷凍離心機(jī)更適宜）：200-500×g，也可選用多頭抽真空裝置（例如：Mallinekrodt-Baker 或Waters）。

8）甲醇（HPLC級(jí)）

9）蒸發(fā)離心機(jī)

10）            可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長(zhǎng)600-650nm）

11）            蒸餾水或去離子水

12）            吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

 

如果溶液的需要量比較大,應(yīng)該將試管內(nèi)的溶液混合.避免反復(fù)凍融。

如果懷疑樣品中的褪黑激素濃度比最高標(biāo)準(zhǔn)品的高，必須將樣品在提取步驟前用檢測(cè)緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。

按照此步驟進(jìn)行提取，提取量大約為90-100%。

為了避免柱子堵塞，提取樣品前將樣品過(guò)濾或離心一下。

1.柱的調(diào)制

2.樣品提取

3、洗滌

4、提取物的洗脫

5.提取物的蒸發(fā)和重新配置

 

在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上或自動(dòng)計(jì)算的方法，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（Y軸，線性）對(duì)其濃度（X軸，對(duì)數(shù)）做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程可以得到更好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在推算標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分利用好每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值（明顯逸出的數(shù)值應(yīng)當(dāng)被忽略，再使用更加合理的數(shù)值代替它）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接讀取。從坐標(biāo)紙上讀取結(jié)果時(shí)應(yīng)當(dāng)把起始的稀釋倍數(shù)考慮進(jìn)去。將稀釋了的樣品結(jié)果乘以稀釋因子即可得到其相應(yīng)的結(jié)果。樣品中抗體濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品，應(yīng)當(dāng)按實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備說(shuō)明所述的方法進(jìn)行稀釋?zhuān)�并重新檢測(cè)。

轉(zhuǎn)換系數(shù)：褪黑激素（pg/ml）×4.30=pmol/l

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

（例子：不能用來(lái)定量）

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作確定治療結(jié)果的唯一因素，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測(cè)相結(jié)合。對(duì)明顯健康的一組人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的褪黑激素水平有著明顯的生理周期變化，褪黑激素白天的水平很低，而晚上的水平則很高，而且個(gè)體之間的差異也很大。此外，褪黑激素的水平也與年齡有關(guān)系，其最高濃度是在嬰兒（3歲）樣品中發(fā)現(xiàn)的。對(duì)6個(gè)明顯健康獻(xiàn)血者的褪黑激素生理周期進(jìn)行研究。褪黑激素大概在白天下午四點(diǎn)最低，其平均值是4.6pg/ml；早晨4點(diǎn)達(dá)到最好，平均值為77.5pg/ml。健康個(gè)體之間的褪黑激素最高值差異很大，建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都確定自己實(shí)驗(yàn)室的正常值范圍。

 

 

 

 

 

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。

 

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