PCR Array 簡單實用的檢測基因表達的高通量方法

H1-H5孔包含了5個看家基因（HK1-HK5），用于芯片數據的標準化。H6為基因組DNA參照（GDC），其中固定的引物能特異性的檢測非轉錄的基因組DNA重復片段，從而檢測樣品中是否存在DNA污染。H7到H9是三個重復的孔，均為反轉錄參照（RTC），用于檢測RT反應的效率。H10到H12是陽性PCR參照（PPC），反映了PCR反應的效率。這些孔中加入了人工合成的DNA序列和相應的引物對。兩組重復的對照RTC和PPC也可以用于檢測芯片間和芯片內的一致性。 

96孔模式的RT²Profiler PCR芯片根據SuperArray的Pathway-Centric ^TM原理設計，將現有的重要信號通路研究進展與PCR芯片方法結合，是檢測信號通路提供獨特的研究工具。在設計PCR芯片時，Superarray公司綜合了文獻資料，數據庫信息，專家意見和用戶反饋，不斷根據客戶需要開發新產品，并使芯片中所包含的基因更完整，更精確。在目前的市場中，SuperArray所提供的信號通路范圍最廣，并且有針對人，小鼠和大鼠的PCR 芯片產品（參見表1以及產品目錄）。在芯片設計中，還整合了預測資料和實驗結果，幫助研究者系統地有針對性的開展研究。這些預設計的PCR芯片，分類詳細，針對性強，使研究者無需自己一一挑選基因，節省大量時間和精力，實驗過程簡便快速，大大推進了生命科學研究進展。目前，預設計的PCR芯片涵蓋了細胞凋亡，炎癥反應，信號傳導，癌癥以及其他疾病等廣泛的生物學通路和疾病。詳細的芯片列表請登陸公司網站查詢。

應用范圍	PCR芯片產品舉例	芯片所包含的部分基因
生物學途徑	人細胞凋亡 （Cat. No. APHS-012）	TNF 配體和受體   BCL2 家族成員 Caspases         死亡效應功能域 ATM和p53信號通路
功能或者結構相關基因	小鼠細胞因子 （Cat. No. APMM-021）	干擾素和白介素    骨形態發生蛋白 腫瘤壞死因子      多種生長因子
信號傳導途徑	人NFKB信號通路 （Cat. No. APHS-025）	細胞外配體和受體  NFκB和IκB 家族成員 激酶 轉錄因子 反應基因
疾病相關	人癌癥信號通路發現者 （Cat. No. APHS-033）	細胞周期控制和DNA損傷修復 細胞凋亡和細胞衰老 細胞黏附 血管生成 浸潤和腫瘤轉移

表1 SuperArray 提供的PCR Array產品舉例

 

如果現有的產品無法滿足研究者的特定需要，SuperArray還可以提供從設計到芯片生產的完整服務，為研究者提供使用先進的PCR芯片的便捷服務�？蛻粲喼菩酒�服務為研究者提供以下便利：1）在使用表達譜基因組芯片后，對從基因組水平篩選出來的一組基因進行驗證；2）在現有產品的基礎上作適當調整以適應特殊需要；3）完全從頭設計，適用于在現有的預設計PCR芯片中尚未包括的某個信號通路或者一組基因。若研究基因數目少于84個，還可以將96孔PCR芯片進一步分成更小的形式，從而可以在一次PCR反應中研究多個樣品�；蛘哌M行多次重復。

有了這些產品和服務，研究者在利用這項新技術時，可以專注于研究自己所感興趣的特定基因組合時，實驗中也更加省時省力。

   完整的PCR芯片實驗體系包括RT²Profiler^TM PCR芯片，RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR反應體系和cDNA合成試劑盒。所有這些組分均為基于SYBR Green的實時定量PCR反應優化。精心設計的引物和優化的PCR反應體系一起，為PCR芯片的特異性提供保證。在反應體系中還加入了指示染料，用于檢測PCR反應平臺的可靠性。

采用PCR芯片開展研究，技術上的難點是如何在同一次實驗中，相同的PCR反應條件下保證不同的基因有相近的擴增效率，并且獲得與單個基因實時定量PCR反應相當的靈敏度，特異性和可重復性。為此，SuperArray首先設計篩選出最佳的候選引物，接著通過實驗，在不同反應條件下，檢測PCR反應體系與幾千條PCR引物的組合，最終獲得了優化的引物和PCR反應體系，適應PCR芯片的要求。 

通過計算機分析和實驗驗證，引物達到以下要求：

1.特異性：通過BLAST等比對方法，檢測確認引物在相應物種（人，小鼠或大鼠）全基因組中的高度特異性，有效避免非特異性產物產生。并通過實驗證明引物不會擴增E.coli基因組，后者是Taq DNA多聚酶的常見污染源。

2.均一性：所使用的引物的CG含量，解鏈溫度（Tm），以及其他一些化學的和物理的特性都相似，以保證在相同的PCR條件（尤其是相同退火溫度）下，芯片中的不同的基因都能擴增出特異性產物。

3.擴增效率：引物擴增的片段大小均在100到200bp左右，確保在相同的反應時間內，不同的基因均能擴增出完整片段；并增強引物3’ 端的鉚定能力，減少引物二聚體和非特異性退火的發生。

在基于SYBR Green的實時定量PCR反應中，PCR反應體系也起到重要作用。嚴格控制的熱啟動Taq酶是一個關鍵因素。RT² Real-Time^TM PCR反應體系采用了一種獨特的，經過化學修飾的熱啟動Taq酶，只有在熱激步驟之后，酶的活性才能完全發揮。在嚴格控制反應條件的情況下，在較低溫度下發生的非特異性引物結合無法進一步擴增。其他的反應體系則常常將這些模板進一步擴增成為非特異性產物，造成假陽性結果。此外，Superarray還對RT² Real-Time^TM PCR反應體系中的化學組分進行優化，進一步減少了引物二聚體的形成，并能保證最難擴增的片段都得到極高的擴增效率。PCR芯片結合了高質量的PCR引物設計和RT² Real-Time^TM PCR反應體系，為PCR的高芯片質量提供了保證。

表格2總結了RT²Profiler^TM PCR芯片的特點。

　

 

                       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表2  RT²Profiler^TM PCR芯片的特點

 

研究者總是希望能檢測到表達量相當低的基因，有時候，研究者得到的起始總RNA量也很少，但仍希望能進行實時定量PCR檢測。為了滿足研究者的這些需要，Superarray嚴格檢測了PCR芯片系統的靈敏度。例如，Superarray使用PCR芯片檢測了一系列總RNA樣本，這些樣本的濃度都不相同，使用的PCR芯片為炎癥細胞因子和受體基因芯片，通常，這些基因的表達量都是很低的。圖3將陽性信號的比例（Ct<35的基因所占百分比）與相應的總RNA量對應起來作圖。結果表明，當起始的總RNA范圍在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）時，每張PCR芯片的陽性信號比率均超過85%。對于表達量更高的基因，芯片檢測的靈敏度還會大大提高，即在起始RNA量更低的情況下，芯片能夠檢測到的陽性信號比例更高。值得注意的是，起始的總RNA量最好不要低于0.5-1.0ug，否則會造成陽性信號損失。由于陽性信號比例在起始RNA量低時會顯著下降，所以在實驗中，檢測的最低RNA量不少于5.0ng。