案例分享：培養基及補料策略對CHO細胞生長及抗體質量的影響

細胞代謝和蛋白質量受多方面因素影響，包括表達系統、工藝條件、培養基及補料策略等。CHO 細胞因自身系統優勢，在生物制藥行業已被廣泛用于各類蛋白藥物的生產表達，越來越受關注。

CHO 細胞是生產蛋白類藥物的首選宿主細胞，尤其在一些復雜的重組蛋白生產中，因其與其他系統相比有以下優點：CHO 細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能，因此其表達的蛋白質的生物學活性更接近于天然蛋白；CHO 細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強，可根據培養要求選擇可貼壁培養或懸浮培養的方式；整合外源基因后的細胞穩定，重組基因能高效擴增和表達；CHO 細胞表達的目的蛋白可由細胞內運輸到細胞外，并且 CHO 細胞只表達少量的內源蛋白，有利于目的蛋白的提取。

培養基及補料策略對 CHO 細胞生長及抗體質量的影響案例分享

1.研究概況        
本研究案例使用化學成分限定的 CHO 細胞培養基及補料策略對不同細胞系進行 batch 和 fed-batch 培養，考察對細胞代謝、抗體濃度及質量的影響。
采用生產相同抗體的 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 細胞系在 ActiPro（GE HyClone）and Media A 培養基中，使用特定濃縮補料進行 batch 和 fed-batch 培養，研究分析不同培養基及補料對于抗體產量、細胞生長、細胞特異性的營養消耗、副產物成分及 IgG 質量的影響。 

2. 材料和方法  
 
3.分析方法
每天抽取樣品以確定細胞濃度，活力，IgG 滴度，代謝物（包括葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、銨），滲透壓。 此外，在第 4 天（指數中期生長期），第 7 天（結束指數生長期）和培養終止日（活力<60％），通過流式細胞儀分析殘留氨基酸濃度，基因拷貝數和 mRNA，細胞內產物含量，通過 SDS-PAGE，Western 印跡，糖基化，聚合體，電荷異構體和熱穩定性等分析抗體質量。
每個試驗組均做三份平行， 通過加入葡萄糖濃縮液將殘留葡萄糖濃度維持在 3 g / L 以上。

4.結果
相比 batch 培養模式，fed-batch 策略可顯著延長培養持續時間，提高細胞峰濃度，抗體終濃度可提高至六倍以上（數據未顯示）。
如下圖所示，當 ActiPro 用作三種重組細胞系（CHO-K1，CHO-DG44 和 CHO-S）的基礎培養基時，可獲得最高的細胞密度和抗體濃度。ActiPro 中較高的比生長速率帶來較高的細胞峰密度和活細胞積分（高達五倍差異）。兩種培養基中細胞生長比較發現 IgG 滴度高達六倍的差異（圖 1B）。IgG 產生的特定速率與三種 CHO 細胞系細胞內輕鏈和重鏈 mRNA 表達水平非常一致（數據未顯示），ActiPro 在 fed-batch 模式中較高的活細胞積分是獲得更高抗體濃度的主要原因。
 
本案例中兩種 fed-batch 策略明顯影響細胞代謝速率，包括營養物質消耗和副產物形成（數據未顯示）。培養于 Medium A 中時，三種細胞系的葡萄糖消耗率均高達 30-55%，而且具有細胞特異性。同時三種細胞系葡萄糖轉化為乳酸的比例也具有明顯差異，其中 CHO S 細胞最低，約為 10-15%，CHO-DG44 細胞 為 25%, CHO-K1 細胞中葡萄糖轉化為乳酸的比例最高，可達 40%。
谷氨酰胺是 CHO 細胞的主要能量來源，谷氨酰胺消耗為高度宿主細胞特異性，同種細胞系在兩種培養基中消耗比例大致相同。三種細胞系在 Media A fed-batch 培養中谷氨酰胺均為凈消耗，而在 ActiPro 培養物中則觀察到凈生成，這一發現可能會影響未來補料策略的設計。兩種培養基中，CHO-K1 細胞系銨生成率保持不變，而在 CHO-S 和 CHO-DG44 細胞系中，ActiPro 相比 Media A 銨生成率低 30-60％。
所有三份 fed-batch 培養物的培養上清液進行純化，通過不同技術分析抗體質量。所有樣品在 SDS-PAGE 上看起來均一，純度高且具有正確的分子量，通過 SEC 測定聚合體小于 5％（數據未顯示）。抗體 Fc 結構域的糖基化變化與 CHO 細胞系的使用以及補料策略有關（數據未顯示），通常高巖藻糖化出現在 CHO-S 細胞系及 Media A 培養基 fed-batch 培養中，CHO-S 和 CHO-K1 細胞系培養于 ActiPro 生產的抗體有更高水平的半乳糖化，甘露糖結構在 CHO-S 中被最有效地加工（最低的高甘露糖結構），然后是 CHO-K1 和 CHO-DG44。

5.總結
本案例中細胞培養基和補料策略對抗體生產過程及產量影響大，不同培養基間細胞峰值密度有 5 倍差別，抗體滴度高達 6 倍差別。細胞代謝速率（例如葡萄糖和谷氨酸）也受培養基的影響，乳酸生產及谷氨酰胺消耗（均有細胞特異性）主要取決于 CHO 細胞系。對于產品質量，培養基和 CHO 宿主細胞系的選擇均可用于微調抗體糖基化，例如巖藻糖基化，半乳糖基化和甘露糖基化等。

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