Elisa實驗—ELISA板包被原理、操作步驟及常見問題解答

　　Elisa實驗：ELISA板包被原理

　　ELISA板包被原理

　　在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)實驗中，包被(Coating) 是最關鍵的第一步，目的是將目標分子(抗原或抗體)固定在微孔板表面，以便后續與檢測物(抗體或抗原)結合。以下是·本生小編對ELISA板包被的詳細原理和步驟的總結：

　　1. 包被的基本原理

　　包被的本質是通過物理吸附或化學偶聯的方式，將蛋白質(抗原/抗體)固定在微孔板(通常是聚苯材質)的孔壁上。

　　(1) 物理吸附(被動包被)

　　原理：聚苯yixi表面具有疏水性，蛋白質在堿性緩沖液(如pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)中會因疏水相互作用和靜電吸附而被動結合到孔板表面。

　　適用對象：

　　大多數蛋白質(如抗體、重組抗原、病毒蛋白等)。

　　不能用于小分子(如半抗原、肽段<10個氨基酸)，因為它們吸附能力弱。

　　(2) 化學偶聯(主動包被)

　　原理：通過化學交聯劑(如EDC/NHS)將蛋白質的氨基(-NH₂)或羧基(-COOH)與微孔板表面的活性基團共價結合。

　　適用對象：

　　小分子抗原(如藥物、激素、短肽)。

　　多糖、脂類等不易吸附的分子。

 

 

　　2. 包被的關鍵步驟

　　(1) 包被緩沖液的選擇

　　常用緩沖液：

　　碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)：最常用，促進蛋白質吸附。

　　PBS(pH 7.4)：適用于某些對pH敏感的蛋白。

　　蛋白濃度：通常1-10 μg/mL(需優化，過高會導致多層吸附，過低則信號弱)。

　　(2) 包被條件

　　溫度：

　　4℃過夜(16-18h)：最穩定，蛋白變性風險低。

　　37℃ 1-2h：快速包被，但可能影響某些蛋白活性。

　　體積：每孔50-100 μL(確保完全覆蓋孔底)。

　　(3) 封閉(Blocking)

　　包被后，孔板表面仍存在未結合位點，需用封閉劑(如BSA、脫脂奶粉、酪蛋白)封閉，防止非特異性結合。

　　封閉液：1-5% BSA或5%脫脂奶粉(PBS/TBS配制)。

　　封閉時間：37℃ 1-2h 或 4℃過夜。

　　3. 影響包被效率的因素

　　因素影響

　　pH堿性(pH 9.6)促進蛋白吸附，酸性(pH <7)可能降低吸附效率。

　　離子強度低鹽緩沖液(如碳酸鹽)比高鹽(如PBS)更利于吸附。

　　蛋白性質疏水性蛋白吸附更強，親水性蛋白可能需要化學偶聯。

　　微孔板材質高結合力板(如Covalink板)適合小分子，普通板適合大分子。

　　溫度和時間低溫(4℃)長時間包被更穩定，高溫(37℃)可能加速蛋白變性。

　　4. 常見問題及解決方案

　　Q1: 包被后信號弱?

　　可能原因：蛋白濃度過低、包被時間不足、緩沖液pH不合適。

　　解決方案：優化蛋白濃度(梯度測試)，延長包被時間，調整緩沖液pH。

　　Q2: 背景高(非特異結合)?

　　可能原因：封閉不充分、洗滌不徹底、抗體交叉反應。

　　解決方案：增加封閉時間，更換封閉劑(如改用酪蛋白)，優化洗滌次數。

　　Q3: 小分子如何包被?

　　解決方案：采用化學偶聯法(如EDC/NHS)或先偶聯載體蛋白(如BSA-半抗原結合)。

　　5. 總結

　　被動包被(物理吸附)：適用于大多數蛋白質，簡單但可能不適合小分子。

　　主動包被(化學偶聯)：適用于小分子抗原，需交聯劑輔助。

　　封閉是關鍵：防止非特異結合，提高信噪比。

　　如果需要特定實驗方案(如抗原包被、抗體檢測等)，可進一步優化緩沖體系和包被條件!

　　Elisa板：

　　注：以上資料僅供參考，不作為實驗依據，如需完整版產品信息請咨詢品牌供應商或技術老師。

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