SMLM技術突破：40微米深度超分辨率成像成功應用于3D細胞培養模型

單分子定位顯微鏡（SMLM）技術自問世以來，以其納米級分辨能力在生物學研究中展現出巨大潛力，但深度成像始終是技術瓶頸。研究團隊提出了一種名為soSMARt的創新解決方案，通過結合自適應光學、單目標光片顯微鏡和微加工設備，實現了深度體積SMLM成像。soSMARt技術利用集成45°微鏡和熒光基準標記的智能設備，在實時校正光學像差和機械漂移的同時，支持全細胞尺度乃至復雜組織的納米級三維重建。該技術不僅提升了成像分辨率和穩定性，還通過自動化流程大幅縮短了采集時間，為生物醫學研究提供了新工具。實驗結果表明，soSMARt在核膜、線粒體網絡和膜受體成像中取得了橫向分辨率達7.0納米、軸向分辨率40.5納米的優異性能，并成功應用于3D細胞培養模型，標志著SMLM技術向深度、定量化邁出關鍵一步。

本論文的重要發現者包括Marine Cabillic、Hisham Forriere、Laetitia Bettarel、Corey Butler、Abdelghani Neuhaus、Ihssane Idrissi、Miguel Edouardo Sambrano-Lopez、Julian Rossbroich、Lucas-Raphael Miller、Jonas Ries、Gianluca Grenci、Virgile Viasnoff、Florian Levet、Jean-Baptiste Sibarita和Rémi Galland。他們的合作研究成果以《In-depth single molecule localization microscopy using adaptive optics and single objective light-sheet microscopy》為題，于2025年9月在《Nature Communications》期刊上在線發表。

重要發現
soSMARt技術的核心在于解決了深度SMLM成像中的三大挑戰：光學像差、機械漂移和體積重建難題。通過自適應光學系統，研究人員首先量化了深度依賴的像差效應。實驗顯示，當成像深度超過10微米時，球形像差會線性增加，導致點擴散函數變形，進而影響定位精度。為此，團隊開發了基于Zernike模式的3N校正算法，利用微設備中嵌入的熒光納米鉆石作為基準點，在成像深度實時校正像差。這一過程結合了60納米均方根值的像散誘導，優化了三維定位的斜率曲線，確保軸向定位精度在40納米以內。值得注意的是，校正后像差對定位的影響降低了21%，顯著提升了重建質量。

實時漂移校正是soSMARt的另一大突破。由于單目標光片顯微鏡的獨特結構，任何橫向漂移都會導致激發光片與檢測平面錯位。團隊開發了SMARtrack軟件，通過跟蹤微設備中均勻分布的納米鉆石標記，實現納米級的三維反饋循環漂移校正。實驗數據顯示，校正后的殘留漂移精度達到橫向6.4納米、軸向12.9納米，優于傳統完美對焦系統。這種主動校正機制允許長達數小時的穩定采集，為體積成像奠定了基礎。在核膜成像實驗中，通過DNA-PAINT技術采集30,000幀圖像，耗時50分鐘，最終重建出297,736個定位點，傅里葉環相關分析顯示徑向分辨率達31納米。

深度學習加速成像進一步拓展了soSMARt的應用邊界。通過集成DECODE算法，團隊將成像時間縮短了一個數量級。在核膜實驗中，僅用1.5小時就完成了20個平面的采集，生成186萬定位點，分辨率達42納米。盡管出現了網格偽影，但傅里葉濾波有效抑制了干擾。這種高密度定位策略為大規模篩查提供了可能，尤其適合動態生物過程研究。

在復雜樣品成像中，soSMARt技術展現了適應性。以HepG2癌細胞球體為例，利用JeWells設備進行三維培養，并通過光片照明實現了30微米深度的SMLM成像。重建后的核膜厚度測量為138納米，雖然當前設備尚不支持全深度基準標記集成，但通過跨相關校正仍獲得了54納米的分辨率。多視角照明潛力為未來擴大視場指明了方向。

創新與亮點
soSMARt技術的創新性首先體現在其多模態集成策略上。傳統SMLM依賴TIRF或HILO照明，局限于近蓋玻片區域，而soSMARt通過單目標光片顯微鏡（soSPIM）架構，將激發光片經45°微鏡反射至樣品深度，實現了光學切片與高數值孔徑收集的兼顧。這種設計突破了多目標光片系統的機械限制，使成像深度擴展至40微米以上。更重要的是，微加工設備中嵌入的熒光基準標記不僅為像差校正提供了參考，還通過SMARtrack軟件實現了實時三維漂移校正，將長期采集的穩定性提升至納米尺度。這種“智能顯微鏡”理念將硬件與算法無縫結合，為自動化成像樹立了新標準。

在光學工程層面，soSMARt的創新在于深度依賴像差的動態校正。團隊首次系統量化了水浸物鏡下的像差變化規律，發現球形像差隨深度線性增加（斜率0.031弧度/微米），并通過自適應光學系統實時補償。相較于傳統方法僅在蓋玻片表面校正，soSMARt在樣品深度直接優化點擴散函數，使像散定位的斜率恢復至理想狀態。這一技術不僅提升了定位精度，還避免了重建偽影，如球形像差導致的“回聲”效應。此外，通過可變形鏡面實現像散誘導與校正的一體化，簡化了系統復雜度，提高了實用性。

soSMARt的亮點還體現在其生物醫學應用的廣度上。在單細胞層面，技術成功應用于核膜、線粒體網絡和膜受體的納米級定量分析。例如，對Jurkat T細胞PD-1受體的簇分析揭示了其在細胞表面的均勻分布，為免疫治療研究提供了新見解。在三維細胞培養模型中，soSMARt與JeWells設備結合，首次實現了球體內部的超分辨率成像，盡管樣品散射和像差挑戰更大，但光片照明的高光子收集效率保證了信噪比。這種兼容性預示著技術在組織工程和個性化醫療中的潛力。

總結與展望
soSMARt技術通過融合自適應光學、單目標光片顯微鏡和智能微設備，成功突破了深度SMLM成像的瓶頸，實現了納米級分辨率的體積重建與定量分析。其在像差校正、漂移控制和自動化采集方面的創新，為細胞生物學和發育生物學研究提供了強大工具。未來，技術有望進一步優化樣品誘導像差校正策略，并擴展至活體動態成像，推動超分辨率顯微鏡在精準醫療和藥物篩選中發揮更大作用。隨著算法與硬件的持續迭代，soSMARt或將成為連接納米世界與宏觀生物系統的橋梁，開啟三維超分辨率成像的新紀元。