Nature文章分享：在體CRISPR screening技術助力發現增強CAR-T靶點
文章來源公眾號：生物快評 作者：bio2you
2025年9月24日, Nature發文《In vivo CRISPR screens identify modifiers of CAR T cell function in myeloma》，這篇文章是哈佛醫學院的Marcela V. Maus教授，她也是麻省總醫院細胞免疫治療項目的主任。
這里指的是CRISPR KO screening技術，簡單介紹一下：就是對一群T細胞轉導gRNA文庫，然后這群細胞中，某一些細胞亞群含有某一種基因敲除的表型。那么在給定一個篩選條件，讓能夠適應這種條件的、基因缺失的細胞群體，優勝劣汰出來。富集的T細胞在通過高通量測序分析是什么gRNA富集了，反推一下就知道是什么基因缺失了。
快速的結論
體外實驗中，敲除RASA2 和 SOCS1 可增強 T 細胞的擴增；而在體內實驗中，缺失PTPN2、ZC3H12A 和 RC3H1則賦予 CAR T 細胞早期的選擇性生長優勢。
值得注意的是，作者發現細胞周期調控因子——細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 1B（CDKN1B） 是限制 CAR T 細胞在體內后期活性的重要因素。
敲除 CDKN1B可增強 BCMA CAR T 細胞對抗原的增殖和效應功能，從而顯著提高腫瘤清除率和整體生存率。
目前在Google Scholar檢索，去掉引用，共有57萬“crispr screening”信息。
文章的細節1）是什么CRISPR篩選系統？
所用的是Mario’ library（有不同類型的gRNA文庫），該文庫靶向的是135個基因敲除，這些基因在一定程度上可能有T細胞的功能相關，每個基因有8個gRNA。對照無意gRNA有100個（靶向基因間區）。
這個篩選體系靶向的基因有限，所以敲除的靶點肯定在這個范圍內，這限制了更大范圍的篩選。
這個篩選所用的載體
載體1：靶向BCMA的CAR（4-1BBZ結構），這個CAR后面利用2A連接CD34t(短截體的CD34)，該載體是表達CAR所用，CD34t是便于檢測CAR表達。
載體2：gRNA載體，該載體通過U6驅動gRNA轉錄，注意這里含有TRAC gRNA和靶向基因gRNA，TRAC gRNA是有兩個目的：其一是為了避免后續體內篩選的BCMA-CAR-T對宿主造成GvHD，其二是為了檢測和分選CD3陽性的T細胞，因為CD3陽性的T細胞即是未發生基因編輯的細胞。串聯PGK1啟動子驅動iCasp9表達，且iCasp9通過2A連接了一個篩選標記LNGFR，icasp9是一個誘導性的安全開關，這些和篩選無關，可以不要。
2）這個篩選怎么操作的？
首先活化T細胞，然后制備含有BCMA-CAR的慢病毒和含有gRNA的文庫的慢病毒。
將上述慢病毒混合感染活化的T細胞，然后通過磁珠篩選去掉CD3陽性的T細胞，即得到了CD3陰性的經過文庫編輯后的T細胞。
然后這些細胞通過尾靜脈注射到含有MM.1S小鼠體內，在第21天在小鼠的骨髓中分離BCMA-CAR-T，最后通過測序關鍵敲除哪個基因的gRNA被富集了。
3）篩選得到什么基因敲除對于CAR-T比較好
紅色是富集的gRNA的基因，即敲除帶來優勢的基因。
藍色為丟失的gRNA的基因，暗示敲除帶來不利影響。
因為這個是一個富集篩選，所以我們通常更加相信富集的敲除的基因更可靠。
題外話：基因敲除篩選真的就是一個“一網打盡”的系統嗎？
目前很多課題組做全基因組基因敲除篩選、過表達篩選，然后按照自己的觀察指標，進行基因富集。對得到靶點后再進行驗證，通常在加上單細胞測序的數據。
似乎“Screening”+“single-cell Seq”是發高分文章的套路。
實際上，某個領域的一些關鍵基因很多都在早期都被發現了。目前想通過大規模的篩選，很難得到你想要的“新”的靶點，大概率是對舊的機制、通路的縫縫補補。
測序和篩選的錢，大概率只是得到了一個文章的“頭”和“引子”。
其次你篩選得到的清單，非常困難得到一個不影響“其他功能”，只有好處的靶點。
最后很多人的篩選標準是“細胞增殖、細胞存活”，很多時候篩選得到了一些抗凋亡、促增長、或者是促癌基因，你所觀察到的指標只是“細胞長快了為富集”，而不是因為你的篩選壓力而富集。
怎么從別人的篩選中獲得自己關心的靶點呢
首先，一般文章會提供篩選的清單，頭部的靶點可能已經被作者重復，那么次要的靶點可以下載下來再看看。如果沒有現成的清單excel，直接下載測序數據，自己用軟件跑一下。
最后我們可以通過專利檢索一下，如果一年左右，作者沒有對發現靶點進行保護，大概率這些東西沒有什么實際作用。
