酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)的基本原理、類型方法與操作流程

一、技術(shù)概述與基本原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種將可溶性抗原或抗體固定于固相載體表面，利用其特異性結(jié)合反應(yīng)，并通過(guò)酶標(biāo)記物催化底物顯色進(jìn)行定性或定量分析的高靈敏度檢測(cè)技術(shù)。

其核心原理基于三個(gè)關(guān)鍵步驟：

固相包被：使抗原或抗體牢固吸附于固相載體（如聚苯乙烯微孔板），并保持其免疫活性。

酶標(biāo)記與特異性結(jié)合：使抗原或抗體與特定的酶（如辣根過(guò)氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP）共價(jià)連接，形成酶標(biāo)結(jié)合物。該結(jié)合物既能與相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，又保留酶的催化活性。

顯色與定量：在反應(yīng)體系中，結(jié)合在固相上的酶量與樣本中待測(cè)物含量成比例。加入酶底物后，底物被催化生成有色產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定吸光度值即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的精確定量。酶的高效催化作用可極大放大信號(hào)，使該方法具備極高的檢測(cè)靈敏度。

二、ELISA主要類型及其方法學(xué)特點(diǎn)
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，ELISA可分為以下幾種主要類型：

1、直接法
流程：將抗原固定于固相載體，直接加入酶標(biāo)一抗進(jìn)行檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)：操作步驟少，耗時(shí)短，避免了二抗可能引起的交叉反應(yīng)。
缺點(diǎn)：信號(hào)無(wú)放大作用導(dǎo)致靈敏度較低；每種待測(cè)物均需制備特異性酶標(biāo)抗體，靈活性差；易因非特異性吸附導(dǎo)致背景較高。

2、間接法
流程：將抗原固定于固相載體，依次加入非酶標(biāo)一抗和酶標(biāo)二抗進(jìn)行檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)二抗放大信號(hào)，靈敏度顯著高于直接法；一種酶標(biāo)二抗可適用于多種同種屬來(lái)源的一抗，經(jīng)濟(jì)且靈活。
缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟增多，周期延長(zhǎng)；二抗可能與固相抗原發(fā)生非特異性結(jié)合，潛在交叉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

3、雙抗體夾心法
流程：使用兩種分別針對(duì)目標(biāo)抗原不同表位的抗體，一種作為“捕獲抗體”包被固相，另一種作為“檢測(cè)抗體”進(jìn)行檢測(cè)（可直接酶標(biāo)記或通過(guò)酶標(biāo)二間接檢測(cè)）。
優(yōu)點(diǎn)：適用于多表位抗原檢測(cè)，具有極高的特異性和靈敏度，是應(yīng)用最廣泛的ELISA形式。
缺點(diǎn)：要求兩種抗體不存在交叉反應(yīng)，且不競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)抗體配對(duì)要求高。

4、競(jìng)爭(zhēng)法
流程：樣本中的待測(cè)抗原（或抗體）與已知量的酶標(biāo)抗原（或抗體）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量的固相抗體（或抗原）。顯色強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成反比。
優(yōu)點(diǎn)：適用于小分子抗原或半抗原的檢測(cè)，對(duì)樣本純度要求相對(duì)較低，數(shù)據(jù)再現(xiàn)性好。
缺點(diǎn)：操作相對(duì)復(fù)雜，靈敏度和特異性通常低于夾心法。

三、核心實(shí)驗(yàn)材料與試劑
1、抗原與抗體
抗原：包括天然提純抗原、重組抗原和合成多肽抗原。要求純度高、免疫原性好。
抗體：可采用多克隆抗體或單克隆抗體。用于包被或標(biāo)記的抗體需具備高純度、高效價(jià)和高親和力。

2、固相載體
最常用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的96孔板。要求吸附性能均一、空白值低、透光性好。使用前需進(jìn)行性能校驗(yàn)。

3、酶與底物系統(tǒng)
辣根過(guò)氧化物酶（HRP）：最常用。常用底物包括OPD（靈敏度高，有潛在致癌性）、TMB（無(wú)致癌性，應(yīng)用廣泛）和ABTS（空白值低）。
堿性磷酸酶（AP）：常用底物為p-NPP。其靈敏度可能高于HRP系統(tǒng)，但制備成本較高，穩(wěn)定性略差。
選擇依據(jù)：酶的催化效率、底物特性、安全性及成本。

4、酶標(biāo)結(jié)合物的制備
常用方法包括戊二醛交聯(lián)法（一步法或二步法）和過(guò)碘酸鈉氧化法（主要用于HRP）。制備的結(jié)合物需純化以去除未結(jié)合的酶和抗體，減少背景干擾。

5、包被與封閉
包被：將抗原或抗體吸附于固相載體，通常使用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液，4℃過(guò)夜孵育。
封閉：使用1%-5%牛血清白蛋白（BSA）或其它惰性蛋白質(zhì)溶液封閉未被占據(jù)的固相表面，以防止后續(xù)步驟的非特異性吸附，降低本底。

四、樣本的采集、處理與保存
1、常見(jiàn)樣本類型：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液、腦脊液、組織勻漿液等。
2、采集與預(yù)處理：
血清/血漿：避免溶血，充分離心去除纖維蛋白原或細(xì)胞成分。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：離心去除細(xì)胞及碎片。
組織樣本：迅速勻漿，離心后取上清檢測(cè)。
尿液：使用無(wú)菌容器，新鮮采集并及時(shí)檢測(cè)或保存。

3、保存原則：
短期（數(shù)日內(nèi)）可于2-8℃保存。
長(zhǎng)期需分裝后于-20℃或-80℃凍存，并避免反復(fù)凍融，以防靶蛋白降解或效價(jià)降低。
所有樣本在檢測(cè)前應(yīng)確保澄清、無(wú)沉淀。

五、雙抗體夾心法ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作流程
以雙抗體夾心法為例，其典型步驟如下：
1、包被：將捕獲抗體稀釋于包被緩沖液中，加入微孔板，4℃過(guò)夜孵育。
2、洗滌：棄去孔內(nèi)液體，使用含吐溫-20的PBS緩沖液（PBST）填充各孔，靜置后棄去，重復(fù)3-5次，以去除未結(jié)合物質(zhì)。
3、封閉：加入封閉液（如5% BSA），37℃孵育1-2小時(shí)，隨后再次洗滌。
4、加樣與孵育：加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本，37℃孵育一定時(shí)間，使抗原與捕獲抗體充分結(jié)合，隨后洗滌。
5、加檢測(cè)抗體：加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體（或先加未標(biāo)記檢測(cè)抗體，再加酶標(biāo)二抗），37℃孵育，洗滌。
6、加底物顯色：加入酶促反應(yīng)底物溶液，避光反應(yīng)一定時(shí)間。
7、終止反應(yīng)與檢測(cè)：加入終止液（如硫酸）終止反應(yīng)，立即于特定波長(zhǎng)下（如TMB為450nm）測(cè)定各孔吸光度（OD值）。
8、數(shù)據(jù)分析：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中待測(cè)物濃度。

六、常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案

七、試劑盒選擇要點(diǎn)
特異性：優(yōu)選采用經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證的、高特異性的抗體對(duì)（尤其是雙單抗配對(duì)）。
靈敏度：根據(jù)樣本中待測(cè)物的預(yù)估濃度范圍，選擇檢測(cè)下限合適的試劑盒。
重復(fù)性：評(píng)估試劑盒的板內(nèi)與板間變異系數(shù)（CV），通常應(yīng)小于15%。
簡(jiǎn)便性與通量：考慮操作步驟的繁簡(jiǎn)、孵育時(shí)間長(zhǎng)短以及是否適用于自動(dòng)化平臺(tái)。

八、ELISA技術(shù)相關(guān)技術(shù)服務(wù)哪里有？
樂(lè)備實(shí)（LabEx）提供ELISA技術(shù)相關(guān)技術(shù)服務(wù)

樂(lè)備實(shí)是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。

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