小鼠樹突狀細胞BMDC的制備過程及應用優勢

在人體復雜的免疫防御網絡中，有一類細胞扮演著"哨兵"與"信使"的核心角色，它們就是樹突狀細胞。它們時刻監視著機體的異常，一旦發現病原體或癌變細胞，便能迅速激活整個適應性免疫系統，發起精準打擊。然而，直接從人體組織中獲取樹突狀細胞不僅困難，而且數量有限，極大地限制了科學研究。于是，科學家們找到了一把解開樹突狀細胞奧秘的金鑰匙------骨髓來源的樹突狀細胞。

一、 什么是BMDC？
骨髓來源的樹突狀細胞，并非直接從生物體內分離得到，而是在實驗室里通過特定的細胞因子誘導小鼠骨髓前體細胞分化而成的一種細胞模型。

簡單來說，其制備過程如下：
1.獲取原料：從小鼠的股骨和脛骨中提取骨髓細胞。
2. 誘導分化：在培養皿中，將這些骨髓細胞與關鍵的細胞因子------粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子共同培養。
3. 發育成熟：經過數天的培養，這些原本未定型的骨髓前體細胞，就會朝著樹突狀細胞的方向發育，形成具有典型樹突狀形態和功能的細胞群體。

雖然BMDC與體內自然存在的樹突狀細胞在表型和功能上存在一些細微差異，但它們完美地復刻了樹突狀細胞最核心的功能特征，使其成為免疫學研究中不可或缺的工具。

二、小鼠BMDC誘導分化protocol

1.小鼠骨髓細胞獲取
1.1 將6-8周齡小鼠頸椎脫臼法處死，取股骨，去除骨周圍的肌肉組織。
1.2 用75%酒精浸泡消毒股骨2分鐘，PBS清洗2次。
1.3 用剪刀剪去股骨兩端，用注射器抽取PBS，針頭從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗直至骨變白。
1.4 收集骨髓懸液，用200目尼龍網過濾。
1.5 濾液1200rpm離心5分鐘，棄上清。
1.6 加入2ml 紅細胞裂解液，室溫裂解3-5分鐘。
1.7 加入10ml PBS，1200rpm離心5分鐘。
1.8 棄上清，加入PBS清洗1次，用10%FBS的1640培養基重懸細胞。

2. BMDC誘導
2.1 用培養基將細胞密度調整為1e6/mL，同時加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此為D0。
2.2 每2天進行半換液，即取出半量培養基，離心收集懸浮細胞，用等體積的培養基重懸，并補充相應濃度的細胞因子后加入皿中。
2.3 D6收集懸浮細胞和貼壁細胞，1200rpm離心5分鐘，棄上清將細胞密度調整為1e6/mL，同時加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此為不完全成熟的BMDC。
2.4 BMDC的完全成熟：在D8加入TNF-α (20ng/mL)，GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，D10收集懸浮細胞和貼壁生長的細胞。

3. 不完全成熟BMDC檢測
3.1 收集細胞：細胞因子干預后，棄培養基上清，用PBS清洗細胞1遍，棄上清，再將貼壁細胞用PBS輕輕吹打重懸。
3.2 計數：用細胞計數儀計數并計算細胞總數，并將按照1e7/mL重懸。
3.3 細胞封閉：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。
3.4 孵育抗體：各加入以下抗體，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

組1：PE anti-mouse CD11c Antibody
APC anti-mouse CD80 Antibody

組2：PE anti-mouse CD11c Antibody
APC anti-mouse CD86 Antibody

3.5 洗滌細胞：用PBS洗滌細胞，去除殘留的抗體，并再次用PBS重懸。
3.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室溫避光孵育5min。
3.7 上機檢測。

4. 完全成熟BMDC檢測
4.1 收集細胞：細胞因子干預后，棄培養基上清，用PBS清洗細胞1遍，棄上清，再將貼壁細胞用PBS輕輕吹打重懸。
4.2 計數：用細胞計數儀計數并計算細胞總數，并將按照1e7/mL重懸。
4.3 細胞封閉：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。
4.4 孵育抗體：各加入以下抗體，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

組1：PE anti-mouse CD11c Antibody
APC anti-mouse CD80 Antibody

組2：PE anti-mouse CD11c Antibody
APC anti-mouse CD86 Antibody

4.5 洗滌細胞：用PBS洗滌細胞，去除殘留的抗體，并再次用PBS重懸。
4.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室溫避光孵育5min。
4.7 上機檢測。

Loosely adherent BM derived cells were harvested and incubated with fluorescently labeled antibodies against various surface antigens.

About 65% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 6, while ~78% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~7% in GM-CSF group, while ~20% in GM-CSF + IL-4 group.

About 95% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 10, while ~98% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~14% in GM-CSF group, while ~40% in GM-CSF + IL-4+TNF-α group.

3. BMDC為何如此重要？
BMDC模型的建立，為免疫學、腫瘤學、疫苗開發和藥物篩選等領域帶來了革命性的便利。

1.穩定且充足的細胞來源
相比于從脾臟或淋巴結中費力分離少量樹突狀細胞，BMDC技術可以在實驗室中輕松獲得數以千萬計、性狀相對均一的細胞，為大規模實驗提供了可能。

2. 研究免疫應答的"理想窗口"
科學家可以利用BMDC來直觀地研究樹突狀細胞的"一生"：
抗原攝取：觀察BMDC如何吞噬、處理蛋白質抗原或病原體。

成熟活化：研究在何種信號（如炎癥因子、病原相關分子模式）刺激下，BMDC會上調主要組織相容性復合體、共刺激分子等，從而完成從"哨兵"到"信使"的轉變。

T細胞激活：在共培養實驗中，直接觀察活化的BMDC如何有效地激活初始T細胞，引發特異性的免疫反應。

3. 腫瘤免疫治療的研發平臺
在癌癥免疫治療領域，BMDC是制備樹突狀細胞疫苗的核心原料。研究人員可以先用腫瘤抗原在體外"訓練"BMDC，再將這群"知情"的BMDC回輸到體內，去教育T細胞精準識別并殺傷腫瘤細胞。這種策略為個性化癌癥治療提供了廣闊前景。

4. 藥物與佐劑的安全性、有效性評估
新型疫苗佐劑或免疫調節藥物的效果如何？BMDC是一個絕佳的"試金石"。通過觀察藥物對BMDC成熟和功能的影響，可以快速預測其在體內激活或抑制免疫反應的能力，為后續的動物實驗和臨床研究提供重要依據。

結語
骨髓來源的樹突狀細胞，這座連接基礎研究與臨床應用的橋梁，以其易得、穩定和功能可靠的特點，極大地加速了我們對免疫系統的理解。從揭秘免疫激活的基本原理，到推動創新療法走向臨床，BMDC作為免疫學家的得力助手，將繼續在人類對抗感染、癌癥和自身免疫疾病的征程中，扮演著不可或替代的關鍵角色。