HCP ELISA方法學驗證——精密度與重復性
當我們已經驗證過HCP ELISA與樣品基質的兼容性，并且找到了樣品的最低需求稀釋度（MRD）后，那么下一步就是驗證ELISA方法的精密度，進而完成法規要求的ELISA方法學驗證的全部流程。
什么是精密度和重復性？
精密度是指多次檢測結果之間的一致性程度，通常以實驗的重復性進行評估，以變異系數（%CV）來表示。
計算公式：%CV=(標準差/平均濃度)×100%
通過此公式，可以評估兩種精密度：
批內精密度：衡量單次實驗內不同復孔之間的重復性。嚴格的批內CV表明樣品讀數不受加樣位置或操作程序的影響。
批間精密度：衡量多次獨立實驗之間的重復性。確保批間CV在可接受范圍內（通常＜15-20%，取決于法規要求）是證明該方法能持續穩定產出可靠結果的關鍵指標。
法規要求
ICH Q2(R1)
方法：在3個濃度水平下至少進行9次測定，覆蓋該測定的分析范圍（在3個濃度下進行3次重復）
標準：未說明。
US FDA
方法：至少在3個濃度水平下進行5次測定，覆蓋該測定的分析范圍（在3個濃度下進行5次重復）
標準：每個濃度水平下精密度的CV%應在±20%范圍內，LLOQ的CV%不應超過25%。
EMA
方法：在4種濃度下至少進行5次測定(在LLOQ、LLOQ的三倍以內、標準曲線濃度的30-50%、ULOQ的至少75%，4種濃度下進行5次重復）。
標準：每一濃度水平質控的批內和批間精密度均不應超過15%，LLOQ的CV%不應超過20%。
常見問題排查：導致CV值偏高的原因
如果實驗結果的CV值高于試劑盒說明書中的預期范圍，那么很可能是操作流程或設備出現了問題，我們建議您按以下步驟進行問題排查與實驗優化。
問題原因：
過度劇烈的洗板是CV值異常偏高的常見原因，包括使用自動洗板機、用力拍板等操作，因其可能導致抗原-抗體復合物發生非特異性解離，進而造成CV值過高。
優化建議：
為實現最佳重復性，我們強烈推薦洗瓶洗板法，可以通過交替方向加入洗液來確保每個孔的清洗時間保持基本一致。有關洗板的詳細操作請參考下文。
如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測結果漂移的問題？
問題原因：
當在低吸光度范圍（如OD值＜0.1）的檢測值出現較大波動時，可能提示酶標儀存在潛在問題。光源、單色器或濾光片的故障可能導致間歇性信號異常或噪聲，此類問題通常無法通過常規校準程序識別，但會對檢測的靈敏度以及定量限（LOQ）和檢測限（LOD）產生顯著影響。該類問題常表現為在空白孔或僅含有非吸附性液體的孔中，孔與孔之間OD值讀數標準偏差達到0.020或更低。
對于HRP-TMB顯色的ELISA，推薦使用雙波長讀數（如檢測波長450nm，參比波長650nm）。通過雙波長讀數法，可從檢測波長（如450nm）處的信號值中扣除非特異性信號（如650nm處的背景OD值），從而提高檢測結果的準確性與可靠性。該方法可以最大限度地減少因污漬或塑料缺陷引起的孔間差異，從而提升精密度與準確度。
（注：質量良好的板條在參比波長（如650nm）的OD值通常很低（平均約0.040），且孔間OD值標準差極小（約0.002）。若實際檢測OD值遠高于0.040且標準差大于0.004，則表明酶標儀可能存在問題。）
3. 試劑污染
問題原因：
Cygnus的ELISA試劑盒靈敏度高達pg/mL至ng/mL級別，實驗室環境中潛在的高濃度分析物（如培養基、上游工藝樣品中的HCP或BSA，濃度可達mg/mL級），非常容易對試劑盒中的關鍵組分造成污染，如果檢測結果出現孔板中個別孔吸光值偏差過大，且同一個試劑盒重復后偏差數據值相似，則可能是孔板的孔、標準品或酶標抗體出現了污染。
優化建議：
盡可能在遠離處理上游樣品的區域內進行ELISA實驗操作，避免交叉使用移液器，做好操作臺面與儀器的清潔，盡可能使用帶有濾芯的吸頭等。
問題原因：
操作不規范，移液器未校準或使用質量不達標的吸頭，均可能對檢測結果的精密度產生不利影響。
優化建議：
邀請另一位分析人員在獨立實驗室中使用不同設備進行平行測試，可能有助于您確定精密度不理想的原因是由于操作人員缺乏經驗，還是常規實驗室工具存在問題，比如移液器未校準或吸頭質量差。
成功完成ELISA方法的精密度與重復性驗證，是確保數據可靠、推動項目前進的基石。Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取，或直接聯系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題，我們的技術支持團隊將竭誠為您提供解決方案和建議。
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