新型結構光照明顯微鏡技術簡化硬件實現近各向同性超分辨成像

超分辨率顯微鏡技術近年來極大地推動了生物成像的發展，但如何在所有空間維度上實現各向同性的分辨率一直是一個重大挑戰。傳統方法往往需要復雜且高度敏感的光學系統，限制了其廣泛應用。本研究提出了一種名為軸向干涉散斑照明結構光照明顯微鏡（AXIS-SIM）的新技術，它通過最小程度的硬件修改，利用簡單背反射鏡產生的構造干涉來增強軸向分辨率，無需額外的相位控制或復雜光束整形。AXIS-SIM不僅提供了優異的光學切片能力，還將軸向分辨率提升至140.1納米，側向分辨率達108.5納米，實現了接近各向同性的超分辨率成像。此外，該技術對校準誤差和樣本誘導像差具有強魯棒性，支持多種生物樣本的高通量三維超分辨率成像。實驗展示了其在細胞膜三維形態可視化、溶酶體和微管的納米級分布解析以及溶酶體運動跟蹤方面的潛力，為生物醫學研究提供了實用工具。

本論文的重要發現者包括Hajun Yoo、Kwanhwi Ko、Sukhyeon Ka、Gwiyeong Moon、Hyunwoong Lee、Seongmin Im、Peng Xi & Donghyun Kim。他們共同發表的論文“Near-isotropic super-resolution microscopy with axial interference speckle illumination”于2025年10月在線發表在Nature Communications上。

重要發現
01技術原理與實驗設計
AXIS-SIM的核心創新在于利用軸向干涉散斑照明來克服三維分辨率各向異性的難題。技術原理基于在寬場隨機散斑照明顯微鏡基礎上，引入一個銀鏡基底放置在樣本臺上，通過鏡面反射產生干涉效應，從而在軸向方向壓縮散斑點擴散函數。與傳統隨機散斑照明相比，AXIS照明通過構造干涉顯著減少了散斑模式的軸向延伸，提升了光學切片能力。實驗光學系統采用倒置顯微鏡框架，使用488納米和633納米激光源，通過旋轉漫射器生成動態散斑圖案，并由電動納米臺沿z軸進行序列掃描，以層析方式捕獲三維圖像。這種設計不僅簡化了光學布局，還避免了復雜相位控制的需求。

通過有限差分時域模擬和實驗驗證，AXIS照明將軸向有效散斑點擴散函數的半高全寬從703.5納米降至156.6納米，提升超過四倍。這種軸向約束能力使熒光信號在焦平面方差增大，從而提高了深度分辨精度。實驗中使用水介質和約100微米的鏡面間隙來減少像差，并通過軸向畸變校正進一步優化成像質量。值得注意的是，AXIS-SIM對鏡面傾斜具有魯棒性，模擬顯示即使鏡面傾斜10度，軸向分辨率增強效果仍與完美對齊相當，這降低了實驗設置的復雜性。

在生物成像方面，AXIS-SIM被用于活U2OS細胞微管和固定U-87 MG細胞膜蛋白的成像。對于活細胞，掃描間隔40納米，通過磷酸鹽緩沖鹽水介質和畸變校正，AXIS-SIM提供了清晰的深度信息，優于三維Richardson-Lucy去卷積圖像。微管結構在軸向視圖上顯示出更銳利的細節，表明顯著的光學切片能力。對于厚固定細胞（約10微米），AXIS-SIM實現了近各向同性超分辨率，空間頻率譜和解相關分析顯示軸向空間頻率提升超過五倍。此外，通過組合多個感興趣區域和增大z掃描間隔（200納米），AXIS-SIM支持大體積成像（86.0×53.2×11.7微米³），展示了高通量潛力。

在動態跟蹤方面，AXIS-SIM能夠捕獲溶酶體的快速細胞內運動。通過時間序列成像，定量分析顯示動態溶酶體的平均速度為79.38納米/秒，其中一些溶酶體在18-24秒間短暫離焦后返回焦平面，體現了高時空分辨率。這種能力使得AXIS-SIM不僅能靜態解析細胞器形態，還能跟蹤動態過程，為細胞生物學研究提供新視角。

創新與亮點
01技術突破與成像難題解決
AXIS-SIM的核心突破在于解決了超分辨率顯微鏡中長期存在的三維分辨率各向異性問題。傳統技術如STED或SIM往往在軸向分辨率上受限，導致結構細節在z軸模糊。AXIS-SIM通過軸向干涉散斑照明，將軸向分辨率提升至140.1納米，側向分辨率108.5納米，分辨率各向同性比達1.29，接近理想各向同性。這一成就得益于簡單的鏡面干涉設計，無需復雜多物鏡系統或精確相位控制，降低了光學復雜性。與需要數百幀圖像的傳統超分辨率光學波動成像相比，AXIS-SIM僅需50-100幀每層即可實現高質量重建，這歸功于超分辨率自相關與兩步去卷積方法的整合，減少了光漂白，適用于光敏感生物樣本。

另一個大亮點是AXIS-SIM的魯棒性。實驗證明，它對鏡面傾斜和樣本誘導像差不敏感，支持高通量成像。這種穩定性使其在生物醫學應用中更具實用性，例如在活細胞成像中跟蹤細胞器運動，或在厚組織樣本中解析精細結構。此外，技術兼容多色成像，銀鏡反射在可見光和近紅外波段均勻，確保了多波長應用的一致性。

02光學生物醫療價值體現
在生物醫療領域，AXIS-SIM的價值體現在其能夠提供高分辨率的三維細胞結構可視化，從而推動細胞生物學和疾病研究。例如，溶酶體作為細胞降解關鍵細胞器，其納米級分布和運動模式通過AXIS-SIM被清晰解析，有助于理解溶酶體相關疾病機制。技術的高吞吐量特性支持大體積樣本成像，如整個細胞或組織區域，為藥物篩選和病理分析提供工具。

從光學工程角度看，AXIS-SIM的簡化設計降低了成本和使用門檻，有望促進超分辨率顯微鏡在臨床和基礎研究中的普及。未來，結合深度學習重建或非線性熒光效應，可進一步優化分辨率各向同性，減少采集時間，最小化光毒性，拓展活體應用。

總結與展望
AXIS-SIM技術通過集成背反射鏡和散斑照明，成功實現了近各向同性的超分辨率顯微鏡，在簡化光學設置的同時提升了軸向分辨率。實驗驗證了其在活細胞和固定細胞成像中的高效性，支持多色和動態跟蹤應用。